copyrightSchmidt, HerbertDetert, Katharina Margarete2024-05-162024-05-162023https://hohpublica.uni-hohenheim.de/handle/123456789/6970https://doi.org/10.60848/2108Contaminations of fresh produce by enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) have been an increasing source of human disease outbreaks in the past few decades. In particular, the large disease outbreak in 2011 in Germany has left many questions about the survival of EHEC in soil and the colonization of plants unanswered. Agricultural soil as a reservoir for EHEC strains represents an important contamination source for crop plants. The use of cattle manure for soil fertilization or contaminated irrigation water can result in the introduction of pathogens in fields. To prevent the transfer of pathogens into the food chain, the German fertilizer ordinance disallows the use of organic fertilizer 12 weeks before harvesting the crop plants. However, it is expected that EHEC survives for longer and therefore continue to pose a risk for crop plant contamination. In this study, the overall survival ability of the pathogenic E. coli O104:H4 strain C227/11Φcu, which represents a stx2a-negative derivative of the 2011 outbreak strain C227/11, in agricultural soil was investigated. Thereby, different environmental conditions, soil types and genetic factors of the bacterial strain were identified as influencing factors. Furthermore, the ability of E. coli O104:H4 strain C227/11Φcu to colonize lamb’s lettuce via the root system was investigated to demonstrate that contamination of soil can result in crop plant contamination. In the first publication, the survival of E. coli O104:H4 strain C227/11Φcu in soil microenvironments containing either diluvial sand or alluvial loam was investigated. Two different temperatures (4°C and 22°C) were used and the samples were incubated for more than 12 weeks. The study aimed to analyze whether cattle manure addition prolongs EHEC survival in the soil microenvironments. In the last step, the survival studies were performed using ΔrpoS and ΔfliC deletion mutant strains of C227/11Φcu. The results demonstrated that E. coli O104:H4 strain C227/11Φcu survived for at least 12 weeks in the soil microenvironment model. The survival rate was influenced by the soil type and the temperature. In more detail, the incubation at lower temperature prolonged the survival rate and pathogens were detected up to 20 weeks after inoculation. The application of contaminated cattle manure increased the survival ability at 22°C. Sigma factor RpoS was recognized as an important factor for soil survival. The rpoS deletion mutants showed significant reduction of the survival period while FliC did not influence the overall survival ability in these experiments. To investigate the influence of further genetic factors of the bacterial strain in more detail and thereby characterize all transcription activities, transcriptome analysis was performed in the second publication. Since the strain showed the best survival in alluvial loam at 4°C, this condition was used for the next experiments. To decrease the amount of competing soil microbiota, the soil samples were autoclaved prior inoculation. After inoculation and after 1 and 4 weeks, samples were taken for RNA isolation. The differential expression analysis was performed using the sample from time point 0 as control. The analysis revealed that stress response genes and genes of the primary metabolism were upregulated after 1 and 4 weeks. In addition, genes and gene sets for the uptake of various carbohydrates or amino acids were upregulated, indicating adaption to an environment with low nutrient availability. Moreover, the results of the second publication demonstrated that persistence of C227/11Φcu in soil is related with a complex interface of metabolic networks. The third paper focused on the colonization of lamb’s lettuce by E. coli O104:H4 strain C227/11Φcu via the root system. Surface-sterilized seeds were cultivated on Murashige-Skoog agar or in autoclaved agricultural soil and migration into the edible portions of the plants was analyzed after 2, 4 and 8 weeks. The results of this publication demonstrated that migration into the edible parts occurred when the surrounding agar or soil was contaminated. This highlighted the threat of plant contamination with pathogenic E. coli on the field as a result of soil contamination.Kontaminationen pflanzlicher Lebensmittel durch enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) stehen in den letzten Jahrzehnten zunehmend mit Krankheitsausbrüchen beim Menschen in Verbindung. Insbesondere der große Krankheitsausbruch in Deutschland im Jahr 2011 hat Fragen zum Überleben von EHEC im Boden und zur Besiedlung von Pflanzen unbeantwortet gelassen. Der landwirtschaftliche Boden stellt als Reservoir für EHEC-Stämme eine wichtige Kontaminationsquelle für Kulturpflanzen dar. Die Ausbringung von Gülle als Dünger oder die Verwendung von kontaminierten Bewässerungswasser kann zu einer Einbringung der Bakterien auf das Feld führen. Aus diesem Grund verbietet die deutsche Düngemittelverordnung die Ausbringung von Gülle bis zu 12 Wochen vor der Ernte, um eine Einbringung in die Nahrungskette zu vermeiden. Es wird jedoch angenommen, dass EHEC Bakterien länger überleben und somit weiterhin ein Risiko für Kontaminationen von Kulturpflanzen darstellen. In dieser Arbeit wurde die Überlebensfähigkeit des pathogenen E. coli O104:H4- Stammes C227/11Φcu, der ein stx2a-negatives Derivat des Ausbruchstammes C227/11 von 2011 darstellt, in landwirtschaftlichen Böden untersucht. Dabei wurden unterschiedliche Umweltbedingungen, verschiedene Bodentypen und genetische Faktoren des Bakterienstamms als Einflussfaktoren identifiziert. Darüber hinaus wurde untersucht, ob E. coli O104:H4 Stamm C227/11Φcu in der Lage ist, Feldsalat über das Wurzelsystem zu kontaminieren. Dies würde verdeutlichen, dass Bodenkontaminationen zu einer Kontamination von Kulturpflanzen führen können. In der ersten Veröffentlichung wurde das Überleben des E. coli O104:H4 Stammes C227/11Φcu in Bodenproben untersucht, die entweder Diluvialsand oder Alluviallehm enthielten. Es wurden zwei verschiedene Temperaturen (4°C und 22°C) verwendet und die Proben mehr als 12 Wochen lang inkubiert. Darüber hinaus sollte untersucht werden, ob die Zugabe von Rindergülle die Überlebensdauer von EHEC im Boden verlängert. Im letzten Schritt wurden die Überlebensversuche mit isogenen ΔrpoS und ΔfliC Deletionsmutanten von C227/11Φcu durchgeführt. Die Ergebnisse der Studie zeigten, dass der E. coli O104:H4 Stamm C227/11Φcu mehr als 12 Wochen in den Böden überlebte. Die Überlebensrate wurde von der Bodenart und der Temperatur beeinflusst. Die Lagerung der Proben bei niedrigeren Temperaturen erhöhte die Überlebensrate, und die Erreger wurden bis zu 20 Wochen nach der Inokulation nachgewiesen. Die Zugabe von Rindergülle beeinflusste und verlängerte das Überleben bei 22°C. Der Sigma-Faktor RpoS wurde als ein wichtiger Faktor für das Überleben im Boden identifiziert. Die rpoS-Deletionsmutante zeigte ein signifikant schlechteres Überleben, während FliC in diesen Versuchen keinen Einfluss hatte. Um den Einfluss der genetischen Faktoren des Bakterienstamms weiter zu untersuchen und dabei alle Transkriptionsaktivitäten zu charakterisieren, wurde in der zweiten Veröffentlichung eine Transkriptom Analyse durchgeführt. Da der Stamm die beste Überlebensrate in Alluviallehm bei 4°C zeigte, wurde diese Bedingung für die nächsten Experimente verwendet. Um den Anteil der konkurrierenden Bodenmikrobiota zu verringern, wurden die Bodenproben vor der Inokulation autoklaviert. Nach der Inokulation sowie nach 1 und 4 Wochen wurden Proben für eine RNA-Isolierung entnommen. Die differenzielle Genexpressionsanalyse wurde mit der Probe vom Zeitpunkt 0 als Kontrolle durchgeführt. Die Analyse ergab, dass Gene der Stressantwort und des Primärstoffwechsels besonders nach 1 und 4 Wochen hochreguliert waren. Gene und Gencluster für die Aufnahme verschiedener Kohlenhydrate oder Aminosäuren wurden stark hochreguliert, was auf eine Anpassung an eine Umgebung mit geringerer Nährstoffverfügbarkeit hinweist. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse der zweiten Veröffentlichung, dass die Persistenz von C227/11Φcu im Boden mit einer komplexen Interaktion von Stoffwechselwegen verbunden ist. Die dritte Arbeit thematisierte die Besiedlung von Feldsalat durch den E. coli O104:H4 Stamm C227/11Φcu über das Wurzelsystem. Oberflächensterilisierte Samen wurden auf Murashige-Skoog-Agar oder in autoklavierten, landwirtschaftlichen Böden kultiviert. Die Migration in die essbaren Teile der Pflanzen wurde nach 2, 4 und 8 Wochen analysiert. Die Ergebnisse dieser Veröffentlichung zeigen, dass die Migration in die essbaren Teile erfolgt, wenn der umgebende Agar oder Boden kontaminiert ist. Dies verdeutlicht die Gefahr einer Kontamination der Pflanzen mit pathogenen E. coli bereits auf dem Feld aufgrund einer Bodenkontamination.engDoctoralThesis