copyrightHasselmann, MartinFölsch, Lina2024-08-262024-08-262024https://hohpublica.uni-hohenheim.de/handle/123456789/16018https://doi.org/10.60848/10971The ectoparasite Varroa destructor causes massive economic damages to the Western honey bee (Apis mellifera) and thus threatens the health of honey bee colonies worldwide. When left untreated, varroa populations can lead to high winter colony losses (Genersch et al. 2010; Traynor et al. 2020; Le Conte et al. 2010). Beekeepers must thus routinely treat against varroa to keep their colonies healthy. A sustainable solution to overcome the varroa problem is selection for varroa resistant honey bees. In addition to studies on natural selection against varroa, there is much interest in breeding varroa resistant honey bees. During varroa resistant selection the focus is often on different selection criteria, such as mite non-reproduction (MNR) and varroa sensitive hygiene (VSH). The selection criteria MNR describes the proportion of non-reproductive mites in a colony (Virag et al. 2022). VSH encompasses the specialized removal behavior of mite infested brood by worker bees (Dietemann et al. 2013; Harbo und Harris 2005). This brood removal interrupts varroa reproduction, which leads to reduced varroa infestation in honey bee colonies. The experiments in thesis were conducted as part of the SETBie project. The SETBie (Selection and Establishment of Varroa-tolerant Bee Colonies) project was a four-year selection project whose objectives included breeding a varroa-resistant honey bee in Baden-Württemberg, Germany. Several institutions and beekeeper organizations cooperated in this project. This dissertation focuses on the factors that trigger VSH behaviour, in addition to documenting the reproductive success of the mite (MNR) in selected colonies. Initial experiments investigated the relationship between VSH and the reproductive success of female Varroa (MNR). A widely held hypothesis was that the reproduction of the mite and the associated nymphal stages in the brood cells triggered the removal behaviour of the workers. However, this hypothesis was disproved by placing mites in capped brood cells and comparing the removal behaviour of reproducing mites with that of mites whose reproduction had been blocked by a special procedure (publication 1). Both groups of mites were removed at a rate of about 40% and did not differ significantly from each other. Therefore, reproduction of the mite could be excluded as a trigger for removal behavior of the workers. This result was supported by simultaneous analysis of VSH behaviour and the proportion of non-reproductive mites (MNR) in a large number of pre-selected colonies. It was also assumed that the increased number of non-reproductive mites (MNR) within a colony is directly connected to VSH behaviour, because the workers would primarily remove the reproductive mites, leaving only non-reproductive mites behind. In addition to providing evidence that mite reproduction is not the trigger of removal behaviour, our analysis of the data collected during the SETBie project showed no correlation between MNR and VSH values (publication 3). The MNR value of a colony therefore does not allow any conclusions to be drawn about the VSH value, which should be taken into account in recommendations for breeding practices. Furthermore, an experiment was conducted to rule out the possibility that removal behaviour effects the normal reproduction of the mite in the next cycle (publication 3). The need for other triggering factors for removal behaviour to occur was clearly demonstrated in this first set of experiments. Varroa mites manipulated to remove specific factors and inanimate objects were placed in capped brood cells to determine what influences removal behaviour. We found that an object (bead) alone does not induce removal behaviour (publication 2). Dead and odour-reduced mites were removed more frequently than the bead and control, but not anywhere near as frequently as live mites. We can thus assume that, in addition to the odour of the mite, the movement of the mite in particular has a signalling effect that triggers this removal behaviour. Other as yet unknown factors such as the reaction of the larvae to the parasitism are likely to play an important role in the removal behaviour of workers. The SETBie project took place over a period of four years, which allowed us to analyse colonies over several generations. Although MNR and VSH are in principle selectable traits, our analysis has shown that they are difficult to improve over multiple generations (publication 4). Colonies with low MNR values could often be improved by crossing them with a drone (artificial insemination) from a colony with a high MNR value. However, it also became clear that it is difficult to maintain high MNR values. Methodological difficulties in targeted selection of MNR/VSH also became noticeable during the collaborative project, which involved the cooperation of numerous breeders. Despite prior infestation of the selected colonies with 180 mites, it was often not possible to collect enough mites to make a valid statement about the reproductive capability of the mite. Even after opening many cells, the minimum number of 10 single infested cells could not be found, which means that MNR values could not be determined for about 63 % of the evaluated colonies due to the presence of too few mites. The selection and breeding work involved in this project is extremely labour-intensive and therefore expensive and requires a high level of expertise among the breeders. It was shown that MNR and VSH are in principle selectable and thus theoretically a Varroa-resistant honey bee line can be bred. However, for future projects, methodological problems need to be resolved or the evaluation methods of the MNR and VSH traits need to be simplified. An optimal solution would be the identification of molecular markers to support selection via genetic heritability. However, this requires further fundamental knowledge about the Varroa mite, the mechanisms that trigger the behaviour of the currently used selection traits, and more precise phenotypic definition of the resistant behaviours.Honigbienenvölker weltweit sind durch den Ektoparasiten Varroa destructor bedroht. Die Varroamilbe verursacht in den Völkern der Westlichen Honigbiene (Apis mellifera) häufig Schäden, die unbehandelt letztlich zum Verlust von Honigbienenvölkern im Winter führen. (Genersch et al. 2010; Traynor et al. 2020; Le Conte et al. 2010). Imker müssen daher jedes Jahr konsequent gegen die Varroamilbe behandeln, um ihre Bienenvölker gesund zu halten. Eine nachhaltige Lösung zur Bewältigung des Varroaproblems ist die Selektion auf varroaresistente Honigbienen. Neben Untersuchungen zur natürlichen Selektion steht dabei oft die Zucht varroaresistenter Honigbienen im Fokus der Forschung. Dabei wird meist der Fokus auf Selektionsmerkmale wie mite non-reproduction (MNR) und Varroa sensitive Hygiene (VSH) gelegt. Das Selektionsmerkmal MNR beschreibt anhand von Brutuntersuchungen den Anteil nicht reproduktiver Milben in einem Volk (Virag et al. 2022). Das VSH-Verhalten erfasst das gezielte Ausräumen von mit Varroamilben befallenen Brutzellen durch Arbeiterinnen (Dietemann et al. 2013; Harbo und Harris 2005). Dadurch wird die Reproduktion der Milben unterbrochen, was mittelfristig zu einem geringeren Varroabefall des Honigbienenvolkes führen kann. Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen des SETBie-Projekts erstellt. Das SETBie-Projekt („Selektion und Etablierung varroatoleranter Bienenvölker“) war ein vierjähriges Selektionsprojekt unter anderem mit dem Ziel, eine varroaresistente Honigbiene in Baden-Württemberg zu züchten. Dazu haben verschiedene Institutionen und Züchtergruppen kooperiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Fokus auf mögliche auslösende Faktoren für das VSH-Verhalten gelegt. In ersten Versuchen wurde dabei der Zusammenhang von VSH mit dem Reproduktionserfolg des Varroaweibchens (MNR) untersucht. Eine weit verbreitete Hypothese ging davon aus, dass die Reproduktion der Milbe und die damit verbundenen Nymphenstadien in den Brutzellen das Ausräumverhalten der Arbeiterinnen auslöst. Diese Hypothese konnte jedoch widerlegt werden, indem Milben in verdeckelte Brutzellen eingesetzt wurden und das Ausräumverhalten gegenüber reproduktiven Milben verglichen wurde gegenüber dem von Milben, deren Reproduktion durch ein spezielles Verfahren unterdrückt wurde (Veröffentlichung 1). Beide Milbengruppen wurden zu etwa 40 % ausgeräumt und unterschieden sich nicht signifikant voneinander. Somit konnte die Reproduktion der Milbe als Signal für das Ausräumverhalten weitgehend ausgeschlossen werden. Unterstützt wurde dieses Ergebnis durch die gleichzeitige Analyse des VSH-Verhaltens und dem Anteil der nicht reproduktiven Milben (MNR) in einer größeren Zahl an vorselektierte Bienenvölker. Bei einem Zusammenhang beider Merkmale sollte ein ausgeprägtes VSH-Verhalten zu einem höheren Anteil infertiler Milben führen, da die Arbeiterinnen in erster Linie die reproduzierenden Milben entfernen würden. Auch hier belegten die Analysen der während des SETBie-Projekts erfassten Daten, dass es keinen Zusammenhang zwischen MNR und VSH gibt (Veröffentlichung 3). Der MNR-Wert erlaubt demzufolge keine Rückschlüsse auf den VSH-Wert, was dringend in den Empfehlungen für die züchterischen Praxis berücksichtigt werden sollte. Zusätzlich konnte in einem weiteren Versuch gezeigt werden, dass die durch VSH ausgeräumten Milben im nächsten Reproduktionszyklus nicht beeinträchtigt sind, VSH also auch keinen direkten Effekt auf die Milbenreproduktion hat (Veröffentlichung 3). Dieser erste Versuchsblock wies klar darauf hin, dass es andere auslösende Faktoren in Bezug auf das Ausräumverhalten geben muss. Um diese Faktoren einzugrenzen, wurden Varroamilben in unterschiedlichem Zustand sowie unbelebte Objekte in verdeckelte Brutzellen eingesetzt. Dabei wurde festgestellt, dass ein unbelebtes Objekt (Glaskugel in der Größe) allein keine Ausräumreaktion hervorruft (Veröffentlichung 2). Tote und geruchsreduzierte Milben wurden bereits häufiger ausgeräumt als diese Objekte, jedoch bei weitem nicht so häufig wie lebende Milben. Somit ist anzunehmen, dass neben dem Geruch der Milbe vor allem die Bewegung der Milbe eine Signalwirkung hat. Vermutlich spielen aber weitere Faktoren wie die Reaktion der Bienenlarve auf die Parasitierung eine wichtige Rolle für das Ausräumverhalten der Arbeiterinnen. Das SETBie-Projekt erstreckte sich über einen Zeitraum von vier Jahren, was es uns ermöglichte, auf MNR und/oder VSH selektierte Bienenvölker über mehrere Generationen hinweg zu untersuchen. Diese Analysen haben zum einen gezeigt, dass MNR und VSH grundsätzlich selektierbar sind (Veröffentlichung 4). Völker mit niedrigen MNR-Werten konnten häufig durch Paarung mit einem Drohn (künstliche Besamung) mit hohem MNR-Wert bzgl. dieser Eigenschaft verbessert werden. Neben diesem positiven Befund wurde jedoch auch deutlich, dass es schwierig ist, hohe MNR-Werte beizubehalten. Das Kooperationsprojekt, in dem auch viele Züchter mitarbeiteten, machte zudem deutlich, welche methodischen Schwierigkeiten bei der gezielten Selektion auf VSH und/oder MNR auftreten. Es war oft nicht möglich, trotz vorheriger Infektion der selektierten Völker mit 180 Milben, genügend Milben für eine valide Aussage über die Reproduktionsfähigkeit der Milbe zu erfassen. Selbst nach dem Öffnen vieler Brutzellen konnte die minimal notwendige Anzahl von 10 einzelbefallenen Brutzellen nicht gefunden werden. Daher konnten z.B. für 63 % der Völker keine MNR-Werte ermittelt werden. Die in diesem Projekt praktizierte Selektions- und Zuchtarbeiten sind extrem arbeitsaufwändig, dadurch teuer und erfordern zudem ein hohes Maß an Kompetenz bei den Züchtern. Es wurde zwar gezeigt, dass MNR und VSH grundsätzlich selektierbar sind und somit die Varroaresistenz durch Zuchtarbeit verbessert werden kann. Allerdings müssten für eine breite Umsetzung methodische Probleme behoben und die Auswertungsmethoden vereinfacht werden. Eine Lösung könnte die Identifizierung von molekularen Markern darstellen, um die Selektion mit genetischen Daten gezielter umzusetzen. Hierfür ist jedoch mehr grundlegendes Wissen über die Varroamilbe, die Mechanismen der verwendeten Selektionsmerkmale und eine präzisere phänotypische Bestimmung der Resistenzparameter erforderlich.570DoctoralThesis