cc_by-nc-ndcc_by-nc-ndKuhn, AndreasQuinten, Tobias2024-04-082024-04-082012-12-172012https://hohpublica.uni-hohenheim.de/handle/123456789/5649Bacteriophage T4 is composed of the three structural subunits i. e. capsid, tail and tail fibres. Because of its contractible tail T4 is a member of the Myoviridae. A characteristic feature of its morphogenesis is the membrane-associated assembly of the head structure during a wild-type infection of E. coli. The portal protein, gp20, and the phage-chaperone gp40 are used to form a membrane-bound complex. Most likely, also proteins from the phage-host E. coli are involved in this process. This complex is the starting point for the assembly of the head-related core and scaffold structure. The mature head detaches from the membrane and is filled with DNA thereafter. In the context of this doctoral thesis the role and function of the portal protein gp20 and its interactions with cellular proteins was analyzed. A His-tag was fused to gp20 and it was purified by nickel-affinity chromatography. Also, interactions with the cellular chaperones DnaK, GroEL, Tig and YidC and the phage-chaperone gp40 were detected after formaldehyde crosslinking. Further studies of the cellular localization showed that gp20 and the fusion protein gp20-GFP are membrane-bound. The importance of YidC and DnaK for this membrane-association was demonstrated by fluorescence microscopy. Phage propagation was not affected by YidC depletion, whereas the loss of DnaK led to a reduced propagation. Prohead-structures, that are an intermediate stage of the capsid assembly, were isolated in YidC-free E. coli-cells membrane-unbound when infected with a phage mutant. Previous studies had led to the isolation of different amber mutants. Mutant amber20E481 was used in this thesis to analyze the assembly process in more detail. Here, under non-permissive conditions a 14 amino acid shortened protein, gp20s, is synthesized. Despite the fact that the capsid assembly is blocked in the non-suppressor strain, the localization and expression of the truncated protein was comparable to the wild type gp20. Overexpressed and His-tagged gp20s was found to crosslink with YidC, GroEL and gp40. Structural studies with a transmission electron microscope showed, that mature proheads were found and these were not filled with phage DNA. Most probably, a malfunction of gp20s during DNA packaging accounts for this.Der Bakteriophage T4 setzt sich aus den drei strukturellen Untereinheiten Kapsid, Schwanz und Schwanzfibern zusammen und gehört aufgrund seiner kontrahierbaren Schwanzhülle zu den komplexen Myoviridae. Eine Besonderheit im Phagenreich stellt die Membran-assoziierte Kapsidmorphogenese während einer T4-Infektion von E. coli dar. Hierbei bildet sich ausgehend von den beiden Proteinen gp20, dem Portalring-Protein des Phagen T4, und dem Phagen-eigenen Chaperon gp40 ein Membran-gebundener Komplex. Eine Beteiligung bakterieller Proteine wurde vermutet. Dieser Komplex dient als Startpunkt für die weitere Kapsidmorphogenese, die durch die Bildung einer Kern- und Gerüststruktur zu reifen Kapsiden führt, die anschließend im Cytoplasma mit DNA gefüllt werden. Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Rolle und Funktion des Portalring-Proteins gp20 sowie seine Interaktionen mit zellulären Proteinen genauer analysiert. Hierzu wurde gp20 mit einem His-Tag versehen, wodurch eine Protein-Reinigung mittels Nickel-Affinitätschromatographie möglich war. Durch die nachfolgende Quervernetzung mit Formaldehyd wurden Wechselwirkungen zwischen His-gp20 und den zellulären Chaperonen DnaK, GroEL, Tig und YidC sowie dem Phagen-eigenen Chaperon gp40 nachgewiesen. Lokalisationsstudien mit gp20-GFP sowie mit wildtypischem gp20 bestätigten den Einfluss von YidC und DnaK auf die Membran-Assoziation des Portalring-Proteins. Die Phagenvermehrung wurde durch YidC-Depletion nicht beeinflusst, wohingegen der Verlust von DnaK zu einer verminderten Vermehrung führte. Vorkopf-Strukturen, die eine Zwischenstufe der vollständigen Kapsidmorphogenese darstellen, konnten mit Hilfe einer Phagenmutante in YidC-freien E. coli-Zellen nicht-membrangebunden isoliert werden. Frühere Studien hatten zur Isolierung verschiedener Ambermutanten geführt. Die Mutante Amber20E481 wurde in der vorliegenden Arbeit verwendet, um die Kapsidmorphogenese genauer zu untersuchen. Es zeigte sich, dass es bei einer nicht-permissiven Infektion zur Synthese einer um 14 Aminosäuren verkürzten gp20-Variante kommt. Obwohl sich das entsprechende Protein, gp20s, in Lokalisations- und Expressionsstudien wie wildtypisches gp20 verhält, ist die Kapsidmorphogenese blockiert. Die überexprimierte und mit einem His-Tag versehene Variante His-gp20s konnte wie das wildtypische gp20 mit YidC, GroEL und gp40 quervernetzt werden. Strukturelle Analysen am Transmissionselektronenmikroskop ergaben, dass die reifen Vorköpfe nicht mit Phagen-DNA gefüllt waren. Wahrscheinlich ist hierfür eine Fehlfunktion bei der DNA-Verpackung verantwortlich.gerProtein-protein interactionInfectionVirion assemblyProheadProtein-Protein InteraktionInfektionVirionmorphogeneseVorkopfGp20570T-PhagenDoctoralThesis376524391urn:nbn:de:bsz:100-opus-7883