publ-ohne-podpubl-ohne-podReustle, GötzBisognin, Claudia2024-04-082024-04-082008-02-132007https://hohpublica.uni-hohenheim.de/handle/123456789/5119Apple proliferation (AP) is an economically important disease of apple which occurs in all countries of central and southern Europe. All currently grown cultivars and rootstocks are susceptible to the disease and no curative treatments are applicable. AP is caused by a phytoplasma, Candidatus Phytoplasma mali, which is restricted to the phloematic tissue of the plant. Ca. P. mali is naturally spread by psyllid vectors and by root bridges as well as by man through infected planting material. An efficient control of the disease is hampered by these different ways of transmission. The objective of the thesis was therefore to evaluate a strategy for a long-term solution to AP based on natural resistance. This resistance has been detected in the wild apomictic species Malus sieboldii and in first and second generation hybrids of M. sieboldii. Although the obtained progeny turned out to be too vigorous for modern apple culture, a certain number of genotypes remained resistant to AP. While phytoplasmas colonise constantly the roots of infected trees, infections in the susceptible cultivar are eliminated each year during the renewal of the phloem in early spring. A resistance strategy towards AP can therefore be solely based on AP-resistant rootstocks in order to prevent the re-colonisation of the canopy in spring. The first part of the thesis was concentrated on the re-evaluation of the AP resistance in M. sieboldii and its hybrids in a 12-years field trial under natural infection pressure at BBA Dossenheim. The annual data for symptom recording and fruit size were analysed as cumulative disease index and cumulative undersized fruit index, respectively. By the end of the trial the phytoplasma concentration in roots and shoots was analysed by quantitative real-time PCR. The results confirmed previous data that M. sieboldii and its hybrids exhibit resistance towards AP. Infected trees of these genotypes had low concentrations of phytoplasmas in the roots and showed almost no symptoms and no undersized fruits. Contrary, previously as resistant classified genotypes derived from M. sargentii reacted highly susceptible. As individual trees of the resistant genotypes showed an altered behaviour, molecular analyses were performed to verify if the seed propagated, apomictic material used for the trial was really true-to-type. For this analysis, co-dominant microsatellite (SSR) markers were used which were derived from published work. However, for each M. sieboldii genotype suitable, polymorphic markers had to be selected. This analysis revealed that apomixis was not complete and that a varying percentage of progeny of the different genotypes was recombinant due to open pollination. As the resistant M. sieboldii genotypes were too vigorous for modern apple culture, new breedings were carried out with these genotypes in combination with dwarfing rootstock genotypes such as M9. More than 3.000 seedlings have been produced in 17 cross combinations. All seedlings were examined by microsatellite analysis in order to distinguish recombinant from non-recombinant, apomictic progeny. SSR markers were also useful in determining the ploidy level of the parents and their progenies. These results were confirmed by flow cytometric analysis. The recombinant progeny is currently being evaluated in the field for its AP resistance. As the screening of resistance towards AP in the field necessitates several years of observation, an alternative in vitro method was developed. This method is based on in vitro graft-inoculation of the genotype to test. As a prerequisite in vitro cultures of all parental genotypes of the breeding program were established. For each genotype the optimal culture medium was defined. Thus, efficient micropropagation and in vitro rooting protocols were established for the M. sieboldii genotypes which are difficult to root under normal nursery conditions. The established protocols enable a large scale production of these genotypes on a commercial scale. The in vitro resistance screening method allows the evaluation of a given genotype under standardized conditions by using repetitions of micro-grafts. The quality of the grafts, the mortality, the transmission rates of the phytoplasmas as well as the concentration of the phytoplasmas in the inoculated genotypes was determined. The results obtained by qPCR showed that the phytoplasma concentration in resistant genotypes was significantly lower than in susceptible ones. Whereas susceptible genotypes exhibited stunted growth and proliferation symptoms in vitro the resistant genotypes had a phenotype almost comparable to the healthy control. Interestingly, significant differences in phytoplasma concentration could be found between two different Ca. P. mali subtypes used in the experiments. The results demonstrated that the method enables a reliable result 3 months p.i. and can be used to evaluate the virulence of different Ca. P. mali strains.Apfeltriebsucht (AT) ist eine ökonomisch bedeutende Krankheit bei Apfel, die in allen Ländern Zentral- und Südeuropas vorkommt. Alle gegenwärtig angebauten Sorten und Unterlagen sind anfällig gegenüber der Krankheit und eine Gesundung ist nicht möglich. AT wird durch ein Phloem-limitiertes Phytoplasma, Candidatus Phytoplasma mali, verursacht, welches durch Insektenvektoren aus der Familie Psyllidae, Wurzelverwachsungen oder bei der Verwendung infizierten Pflanzmaterials verbreitet wird. Durch diese verschiedenen Übertragungswege wird eine effiziente Bekämpfung der Krankheit erschwert. Ziel dieser Arbeit war es daher, eine Strategie für eine langfristige Lösung der AT basierend auf natürlicher Resistenz zu entwickeln. Resistenz ist in der wilden apomiktischen Art Malus sieboldii sowie in den Hybriden der ersten und zweiten Generation entdeckt worden. Während Phytoplasmen die Wurzeln infizierter Bäume konstant besiedeln, werden Infektionen in den anfälligen Sorten jedes Jahr mit der Erneuerung des Phloems im zeitigen Frühjahr eliminiert. Eine Resistenzstrategie gegenüber AT kann daher auf die Entwicklung AT-resistenter Unterlagen beschränkt werden, um eine Wiederbesiedlung der Baumkrone im Frühjahr zu verhindern. Der erste Teil dieser Doktorarbeit konzentrierte sich auf die Überprüfung der AT-Resistenz in M. sieboldii und seiner Hybride im Rahmen eines 12-jährigen Feldversuchs unter natürlichem Infektionsdruck. Die jährlichen Daten zu Symtombeobachtung und Fruchtgröße wurden als kumulativer Krankheitsindex bzw. als kumulativer Index der Kleinfrüchtigkeit analysiert. Zu Versuchsende wurde die Phytoplasmakonzentration in Wurzeln und Sproß mithilfe der quantitativen real-time PCR (qPCR) ermittelt. Die Ergebnisse bestätigten frühere Daten, dass M. sieboldii und seine Hybride eine Resistenz gegenüber AT aufweisen. Infizierte Bäume dieser Genotypen hatten niedrige Phytoplasmakonzentrationen in den Wurzeln und zeigten kaum Symptome und keine Kleinfrüchtigkeit. Im Gegensatz dazu verhielten sich ursprünglich als resistent klassifizierte Genotypen der Elterngeneration von M. sargentii als anfällig. Da einzelne Bäume der resistenten Genotypen ein abweichendes Verhalten zeigten, wurden molekulare Untersuchungen durchgeführt, um zu überprüfen, ob das für dieses Experiment verwendete Samen-vermehrte apomiktische Material wirklich typenecht war. Für diese Analyse wurden aus der Literatur entnommene ko-dominante Mikrosatelliten Marker (SSR) verwendet. Für jeden M. sieboldii-Gentoyp mussten jedoch noch passende, polymorphe Marker selektiert werden. Diese Untersuchung ergab, dass die Apomixis nicht vollständig ist und dass ein variabler Prozentsatz der Nachkommenschaft der verschiedenen Genotypen auf Grund offener Bestäubung rekombinant ist. Da die resistenten M. sieboldii-Gentoypen zu starkwüchsig für den modernen Apfelanbau waren, wurden neue Kreuzungen dieser Gentoypen in Kombination mit schwachwüchsigen Unterlagen-Genotypen wie M9 durchgeführt. Es wurden mehr als 3000 Sämlinge in 17 Kreuzungskombinationen produziert. Alle Sämlinge wurden mithilfe der Mikrosatellitenanalyse untersucht, um rekombinante von nicht-rekombinanten, apomiktischen Nachkommen zu unterscheiden. SSR Marker erwiesen sich auch als geeignet, um den Ploidiegrad der Eltern und ihrer Nachkommen zu bestimmen. Diese Ergebnisse wurden durch flowzytrometrische Analysen bestätigt. Da die Beurteilung der Resistenz gegenüber AT im Feldversuch mehrjährige Beobachtungen erfordert, wurde eine alternative in vitro Methode entwickelt. Diese Methode basiert auf der in vitro-Pfropfinokulation des zu untersuchenden. Als Voraussetzung wurden in vitro Kulturen von allen Elterngenotypen des Kreuzungsprogramms etabliert. Für jeden Genotyp wurde das optimale Kulturmedium bestimmt. Auf diese Weise wurden effiziente Protokolle für die Mikropropagation und die in vitro-Bewurzelung von solchen M. sieboldii-Genotypen erstellt, die unter normalen Baumschulbedingungen schwer zu bewurzeln sind. Die entwickelten Protokolle ermöglichen eine Massenproduktion dieser Genotypen in wirtschaftlichem Maßstab. Die Verwendung von Wiederholungen der Mikropropfungen bei der in vitro screening-Methode erlaubt die Beurteilung eines bestimmten Genotyps unter standardisierten Bedingungen. Bewertet wurden die Qualität der Pfropfungen, die Mortalität, die Übertragungsrate der Phytoplasmen sowie die Phytoplasmakonzentration in den inokulierten Genotypen. Die Messungen mittels qPCR ergaben, dass die Phytoplasmakonzentration in den resistenten Genotypen signifikant niedriger war als in anfälligen. Während anfällige Genotypen in vitro Kümmerwuchs und Symptome von Proliferation zeigten, war der Phänotyp der resistenten Genotypen nahezu vergleichbar mit dem der Gesundkontrolle. Interessanterweise wurden zwischen den beiden in diesen Versuchen verwendeten Ca. P. mali-Subtypen signifikante Unterschiede in der Phytoplasmakonzentration gefunden.engApple proliferationApple breedingApple rootstockTissue cultureResistancePhytoplasmenMikrosatelliten MarkerApfelunterlagen630ApfeltriebsuchtResistenzGewebekulturApfelkrankheitApfelzüchtungDoctoralThesis277205042urn:nbn:de:bsz:100-opus-2217