publ-ohne-podpubl-ohne-podBreer, HeinzLuxenhofer, Georg2024-04-082024-04-082009-01-152008https://hohpublica.uni-hohenheim.de/handle/123456789/5210Olfactory sensory neurons (OSN) expressing a particular odorant receptor (OR) are widely scattered throughout the olfactory epithelium (OE) of the nose and send their axon into a small number of common glomeruli in the olfactory bulb (OB). In a spatially well conserved pattern these axons establish synaptic contacts to second order neurons. The molecular mechanisms underlying the precise wiring are still not well understood. To generate a system which may facilitate the investigation of distinct aspects of this complex process, an in vitro culture with tissue explants from the olfactory system was established in the present work. The use of tissues from transgenic mice which enabled the visualisation of OSN and their processes by intrinsic fluorescence allowed a continuous observation of distinct axonal populations under defined and manipulable conditions. Cells within an explant from the OE harvested at the embryonic stage 14 (E14) extended numerous axonal processes within a few days which grew out radially and without fasciculation. During the initial culture period the explants contained mainly progenitor cells; after several days in culture cells differentiated to OMP-positive, thus mature OSN. Using receptor specific transgenic mouse lines the expression of distinct OR genes in a subpopulation of OSN could be detected. Altogether, the culture conditions thus allowed the differentiation of progenitor cells into OSN with characteristic gene expression. Concerning the key question of how axons of OSN interact with their target tissue, co-culture experiments with OB tissue were performed; they showed that axons were initially repelled by their target. A precultivation of OB tissue, however, resulted in an attraction of axons even from larger distances. Moreover, the bulb tissue exerted a positive effect on the growth rate of OSN axons. During their growth these axons formed bundles which defasciculated in the vicinity of the OB explants. These results showed that characteristic parameters in the generation of OSN, their axonal growth and interactions with the target tissue were recapitulated by the in vitro culture system, thus, providing optimal conditions for the examination of key questions regarding the molecular mechanisms involved in establishing the unique projection pattern. Subsequently, the explant culture system was used to investigate the role of the odorant receptor protein in the process of path finding. Expression of genetically modified receptor variants in the explants revealed novel insights into the subcellular localisation of the odorant receptor mOR256-17. An mOR256-17-EGFP fusion protein could be detected in vesicles transported into the dendrite of OSN, resulting in an accumulation of the OR in the cilia. Using this technique it was possible to observe for the first time OR proteins in vesicles which were transported anterogradely and retrogradely along the entire axon. The OR could be visualised within the growth cones and the attached filopodia. Taking advantage of a novel detection method in which proteins integrated into the plasma membrane were selectively marked, retrogadely transported vesicles containing internalised mOR256-17 protein could be observed. The generation of an OR variant, in which the G-protein binding domain was mutated resulted in a disturbed localisation of the OR protein within OSN. Hence, by developing an improved in vitro explant system, an important tool was generated that allowed novel insights into the function of distinct molecular components and should be valuable for future studies aimed at understanding the complex processes that lead to the precise connection of OSN with their target.Olfaktorische Sinnesneurone (OSN), die mit einem bestimmten Odorantrezeptor (OR) ausgestattet sind, liegen weit verstreut im olfaktorischen Epithel (OE) der Nase und senden ihr Axon in gemeinsame Glomeruli im olfaktorischen Bulb (OB). In einem räumlich hochkonservierten Muster werden dort rezeptorspezifisch synaptische Kontakte mit nachgeschalteten Projektions- und Interneuronen hergestellt. Über die molekularen Mechanismen, die dieser höchstpräzisen Verdrahtung zugrunde liegen ist trotz intensiver Forschung noch immer wenig bekannt. Im Hinblick auf eine Aufklärung der komplexen Prozesse ist ein geeignetes experimentelles System erforderlich, das eine gezielte Manipulation der auswachsenden Axone ermöglicht. In der hier vorliegenden Arbeit wurde daher zunächst ein in vitro System mit Gewebeexplantaten des olfaktorischen Systems etabliert. Die Verwendung transgener Mauslinien, in denen spezifische Sinneszellpopulationen inklusive aller zellulären Ausläufer durch intrinsische Fluoreszenz visualisierbar sind, erlaubte eine kontinuierliche Beobachtung distinkter Axonpopulationen unter definierten und manipulierbaren Bedingungen. Zellen in Explantaten des OE, die zum Zeitpunkt des Embryonalstadiums 14 (E14) in Kultur gebracht wurden, entwickelten nach wenigen Tagen zahlreiche axonale Ausläufer, die radiär und unfaszikuliert aus den Explantaten auswuchsen. Die Explantate enthielten nach kurzer Kultivierung hauptsächlich Vorläuferzellen von olfaktorischen Sinneszellen; nach einigen Tagen konnten bereits zahlreiche reife Sinneszellen mit robustem Axonwachstum nachgewiesen werden. Durch den Einsatz einer rezeptorspezifischen transgenen Mauslinie konnte weiterhin die Expression distinkter OR Gene in Subpopulationen von Sinneszellen sichtbar gemacht werden. Die Kulturbedingungen erlaubten also die Differenzierung von Vorläuferzellen zu typischen olfaktorischen Sinnesneuronen mit charakteristischer Genexpression. Bezüglich der zentralen Frage zu Interaktionen zwischen olfaktorischen Axonen und ihrem Zielgewebe zeigten Kokultur-Experimente, dass ein Kontakt der Axone mit dem OB Gewebe zunächst eine repulsive Wirkung hatte. Erst eine Vorkultivierung des OB Gewebes resultierte in einer attraktiven Wirkung, wodurch die Axone sogar aus großen Entfernungen vom OB angezogen wurden. Die Anwesenheit des Bulbusgewebes hatte zudem einen positiven Einfluss auf die Wachstumsgeschwindigkeit der Axone. Dabei kam es zunächst zu einer starken Bündelung von Axonen, die in unmittelbarer Nähe des OB wieder in einzelne Fasern defaszikulierten. Diese Ergebnisse zeigten, dass mit dem in dieser Arbeit etablierten Explantatsystem charakteristische Parameter der Generierung olfaktorischer Sinneszellen, des Auswachsens von Axonen und der Interaktion der Axone mit ihrem Zielgewebe in vitro rekapituliert werden konnten. Somit wurden ideale Voraussetzungen dafür geschaffen, um zentrale Fragestellungen zu den molekularen Mechanismen zu bearbeiten, die der Etablierung der einzigartigen Verschaltung in diesem System zugrunde liegen. Die Explantatkulturen wurden im Folgenden dazu genutzt, die Rolle, die das olfaktorische Rezeptorprotein bei dem Prozess der olfaktorischen Wegfindung spielt, näher zu untersuchen. Durch Expression von genetisch modifizierten Varianten des Odorantrezeptors mOR256-17 in den Explataten konnten neue Einblicke in dessen subzelluläre Lokalisation gewonnen werden. Anhand eines mOR256-17-EGFP Fusionsproteins wurde ein vesikulärer Transport in die Dendriten der Sinneszellen sichtbar, welcher in einer Akkumulation des OR Proteins in den Cilien resultierte. Erstmals wurde mit dieser Technik das OR Protein in vesikulären Strukturen des Axons sichtbar, die anterograd und retrograd transportiert wurden. Der Rezeptor konnte in den Wachstumskegeln wachsender Axone und dort speziell in den Filopodien visualisiert werden. Mittels einer neuartigen Nachweismethode, mit der selektiv Proteine markiert werden können, die in der Plasmamembran lokalisiert sind, konnte ein retrograder Transport von internalisierten mOR256-17 Proteinen beobachtet werden. Die Generierung einer OR-Variante, bei der die Interaktionsdomäne des Rezeptors mit G-Proteinen mutiert wurde, resultierte in einer gestörten Verteilung des OR Proteins in den Sinneszellen. Insgesamt wurde mit dem in dieser Arbeit etablierten in vitro System ein entscheidendes Werkzeug geschaffen, mit dem bereits neue Einblicke in die Funktion distinkter molekularer Komponenten gewonnen wurde und dessen zukünftiger Einsatz zum weiteren Verständnis der komplexen Prozesse bei der Projektion olfaktorischer Sinneszellen beitragen kann.gerAxon guidanceIn vitro cultureOlfactionSensory neuronsOdorant receptorWegfindungGeruchsrezeptorOlfaktorische Sinnesneurone570AxonIn-vitro-KulturGeruchDoctoralThesis301546738urn:nbn:de:bsz:100-opus-3203