cc_by-nc-ndcc_by-nc-ndFritz-Steuber, JuliaHalang, Petra2024-04-082024-04-082014-08-062014https://hohpublica.uni-hohenheim.de/handle/123456789/5822The human pathogen Vibrio cholerae is able to inhabit a variety of environments. These include especially aquatic ecosystems, but the human intestine as well. V. cholerae is thus tolerant to a wide range of salinity and pH. Motility is achieved by a sodium driven polar flagellum. The affinity for Na+ to run the flagellum is determined by the stator complex PomAB, which is embedded in the cell membrane within the flagellar motor. A critical aminoacid residue for the binding of Na+ is aspartate 23 within the transmembrane helix of PomB. A mutation of this aminoacid residue leads to an immotile phenotype of V. cholerae. It was thus of interest to investigate if other polar or acidic aminoacid residues within PomB are important for the passage of Na+. Two potential candidates are serine at position 26 and aspartate at position 42 of PomB, both aminoacid residues are conserved within sodium driven flagellar stator complexes. To characterize the pathway of Na+ through the PomAB channel, the influence of chloride salts (Na+ and K+) and the pH on the motility of V. cholerae was studied. Motility decreased at elevated pH but increased if a chaotropic chloride salt was added, which excludes a direct Na+ and H+ competition in the process of binding to the conserved PomB D23 residue. Cells expressing the PomB S26A/T or D42N variants lost motility at low Na+ concentrations but regained motility in the presence of 170mM chloride. The swimming speeds of individual cells were also analyzed and revealed that S26 located within the membrane helix of PomB is required to promote very fast swimming of V. cholerae. Loss of hypermotility was observed with the S26T variant of PomB which was partially restored by lowering the pH of the external medium. Modification of PomA and PomB by N,N’-dicyclohexylcarbodiimide indicates the presence of protonated carboxyl groups in the hydrophobic regions of the two proteins. Na+ did not protect PomA and PomB from this modification. It could be demonstrated that the motility of V. cholerae is influenced by the pH and osmolality of the medium and thus, the aminoacid residues – S26 and D42 together with D23 – of PomB have a function in the passage of Na+ into the cell. The H+ rather than the Na+ concentration determines the efficiency of the motor, indicating the presence of a catalytical important hydrogen bond network in the motor channel. It is proposed that D23, S26 and D42 of PomB are part of an ion-conducting pathway formed by the PomAB stator complex. As mentioned above, V. cholerae is a pathogen which settles the human intestine. As other pathogens are able to respond specifically to the stress associated mammalian hormones epinephrine and norepinephrine it was of an interest to investigate the influence of these hormones on growth and motility of V. cholerae. The response to epinephrine and norepinephrine is mediated by the QseC sensor protein. The genome of V. cholerae comprises a gene which is homolog to qseC from E. coli. Growth and swarming of V. cholerae was enhanced in the presence of 0.1mM epinephrine or norepinephrine. qRT-PCR experiments revealed increased expression of the genes encoding the putative sensor kinase qseC and pomB, a component of the flagellar motor complex under the influence of catecholates. HPLC measurements of bacterial supernatant revealed that norepinephrine is completely degraded or metabolized after 48 h in the presence of V. cholerae, concomitant with the appearance of another, unidentified compound. On the other hand, V. cholerae seemed to stabilize epinephrine. After 48 h, 0.46% of the epinephrine added at the beginning of the growth experiment was retained. Again, a yet unidentified compound was detected. The experiments conducted in this work strongly indicate the presence of a catecholate receptor in V. cholerae.Das für den Menschen pathogene Bakterium Vibrio cholerae ist in der Lage eine Vielzahl von unterschiedlichen Lebensräumen zu besiedeln. Diese beinhalten vor allem aquatische Ökosysteme, aber auch den menschlichen Dünndarm. V. cholerae ist daher in der Lage sich einem breiten pH Bereich und unterschiedlichen Salzkonzentrationen in der Umgebung anzupassen. Beweglich wird V. cholerae durch den Besitz eines polaren Flagellums, welches durch Na+ angetrieben wird. Die Affinität für Na+ wird festgelegt durch den membranständigen Statorkomplex PomAB, welches innerhalb des Flagellenmotors liegt. Ein wichtiger Aminosäurerest für die Bindung von Na+ ist hierbei das Aspartat 23 in der transmembranen Helix von PomB. Eine Mutation dieser Aminosäure führt zu einem immotilen Phänotyp von V. cholerae. Es war daher von Interesse, andere polare oder saure Aminosäuren innerhalb von PomB zu untersuchen, die ebenfalls wichtig sein könnten für den Transport von Na+. Zwei mögliche Kandidaten sind hierbei das Serin an Position 26 und das Aspartat an Position 42 von PomB. Beide Aminosäuren sind innerhalb der natriumbetriebenen Statorkomplexe konserviert. Um den Weg des Na+ durch den PomAB Kanal zu charakterisieren, wurde der Einfluss von Chloridsalzen (Na+ und K+) im Medium und der pH des Mediums auf die beweglichkeit von V. cholerae untersucht. Die Beweglichkeit nimmt unter erhöhtem pH ab, nimmt aber wieder zu, wenn chaotrope Chloridsalze dem Medium beigefügt wurde. Dies schließt eine direkte Konkurrenz um die Bindung an dem konservierten D23 in PomB zwischen Na+ und H+ aus. Zellen, die PomB S26A/T oder D42N Varianten exprimieren, waren unbeweglich bei niedrigen Na+ Konzentrationen, erlangten ihre Beweglichkeit wieder durch die Zugabe von 170mM Chlorid. Die Schwimmgeschwindigkeiten einzelner Zellen wurde ebenfalls in dieser Arbeit untersucht. Die Messungen ergaben, dass S26 in der transmembranen Helix von PomB wichtig ist, um sehr schnelle Schwimmgeschwindigkeiten zu erreichen. Hypermotilität in der S26T Variante von PomB konnte teilweise durch das Absenken des pHs im Medium wiedererlangt werden. Die Modifizierung von PomA und PomB durch N,N’-dicyclohexylcarbodiimide deutet darauf hin, dass in den hydrophoben Regionen der beiden Proteine, protonierte Carboxylgruppen vorhanden sind. Na+ konnte PomA und PomB nicht vor dieser Modifikation schützen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Beweglichkeit von V. cholerae durch den pH und die Osmolalität des Mediums beinflusst wird. Die Aminosäuren S26 und D42 zusammen mit D23 von PomB spielen eine Rolle im Na+ Transport in die Zelle. Außerdem prägt eher die H+ als die Na+ Konzentration der Umgebung die Effizienz des Motors, was auf ein katalytisch wichtiges Netz aus Wasserstoffbrückenbindungen hindeutet. Es wird postuliert, dass D23, S26 und D42 von PomB beim Transport von Na+ durch den PomAB Kanal eine Rolle spielen. Wie bereits oben erwähnt, ist V. cholerae in der Lage, den menschlichen Dünndarm zu besiedeln. Es ist bereits bekannt, dass andere pathogene Mikroorganismen in der Lage sind, auf die Stresshormone Adrenalin und Noradrenalin von Säugetieren zu reagieren. Es war daher von Interesse,den Einfluss dieser Hormone auf das Wachstum und die Beweglichkeit von V. cholerae hin zu untersuchen. Das membranständige Sensorprotein QseC erkennt in pathogenen Bakterien die Hormone Adrenalin und Noradrenalin. Und auch V. cholerae besitzt ein Gen, welches homolog ist zu qseC aus E. coli. Das Wachstum und Schwärmverhalten von V. cholerae wurde durch die Zugabe von 0.1mM Adrenalin und Noradrenalin im Medium verstärkt. Außerdem stieg unter Einfluss der Katecholate die Expressionsrate der Gene qseC, welches für eine hypothetische Sensorkinase kodiert und pomB, welches für ein Protein des Flagellenmotors kodiert. Messungen des bakteriellen Überstandes mittels HPLC ergaben, dass nach 48 h Noradrenalin komplett in ein noch nicht näher charakterisiertes Produkt abgebaut oder von V. cholerae metabolisiert wurde. Auf der anderen Seite scheint V. cholerae Adrenalin im Medium zu stabilisieren. Nach 48 h konnte noch 0.46% des zu Beginn der Experimente eingesetzten Adrenalins wiedergefunden werden. Aber auch hier wurde wieder ein noch nicht identifizierter Stoff detektiert. Die Experimente, die in dieser Arbeit durchgeführt wurden, deuten sehr stark darauf hin, dass V. cholerae ein Rezeptor für Katecholate besitzt.engVibrio choleraeFlagellaEpinephrineNorepinephrineMotility570Vibrio choleraeFlagellaAdrenalinNoradrenalinMotilitätDoctoralThesis410470554urn:nbn:de:bsz:100-opus-9920