publ-ohne-podpubl-ohne-podFöller, MichaelMünz, Sina2024-04-082024-04-082023-12-112023https://hohpublica.uni-hohenheim.de/handle/123456789/6910Cellular stress is defined as the impairment of regular cell function by internal or external stimuli including critical temperatures, energy deficiency, infections, mechanic injury, or chemical noxae. The present thesis aims to investigate the influence of cellular stress on the expression of FGF23 and αklotho. FGF23 is predominantly produced in bone and regulates the phosphate excretion in the kidney. Thereby, αklotho functions as a co-receptor for FGF23. By binding to the FGF receptor-αklotho complex, FGF23 reduces the reabsorption of phosphate from the tubular lumen by decreasing the abundance of sodium-phosphate co-transporters. Furthermore, FGF23 decreases the synthesis of 1,25(OH)2D3, active vitamin D, and increases its degradation. 1,25(OH)2D3 is a regulator of intestinal phosphate absorption and therefore, FGF23 additionally reduces dietary phosphate uptake. Chronically elevated FGF23 is associated with numerous disorders such as kidney disease or CVD. Beside its function as a co-receptor of FGFR, αklotho has many beneficial FGF23-independent functions. It has originally been identified as an anti-aging hormone, as a loss-of-function mutation in the αklotho gene causes numerous aging-like symptoms such as vascular and tissue calcification, osteoporosis, sterility, and an early death. The present papers investigated the influence of cytostatic drugs cisplatin, paclitaxel, and doxorubicin as well as apoptosis inducers PAC-1 and serum depletion on the regulation of FGF23 and αklotho. In UMR106 rat osteoblast-like osteosarcoma cells, a 24 or 48 h-treatment with cisplatin, doxorubicin, PAC-1, or serum reduction and depletion significantly up-regulated Fgf23 expression. Under serum depletion, also FGF23 protein secretion was increased. In addition to FGF23, cisplatin and doxorubicin also increased gene expression of pro-inflammatory cytokine Il6 hinting at the presence of necrotic cell death. By inhibiting Il-6 membrane receptor gp130 it has been shown, that FGF23 stimulation partially depended on IL-6 signaling. The stimulation of FGF23 by inflammatory mediators including IL-6, TNFα, TGF-β, or IL-1β has already been reported by others. Furthermore, inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, CKD, or inflammatory bowel disease are associated with excess FGF23 serum concentrations. In this regard, we investigated gene expression and activation of the transcription factor NFκB, which regulates numerous inflammatory functions. Cisplatin and doxorubicin increased the expression of NFκB subunit Rela and cisplatin also stimulated the phosphorylation of NFκB. Independently, NFκB inhibitors wogonin and withaferin A attenuated cisplatin-mediated stimulation of FGF23 indicating, that FGF23 excess was in part promoted by NFκB signaling. These investigations confirmed a strong impact of cisplatin or doxorubicin-induced inflammation on FGF23 synthesis, whereas PAC-1 and serum depletion have reported to directly induce apoptosis, which is commonly not associated with inflammation. Known factors, induced by all cytotoxic substances used here, are the formation of ROS and activation of HIF1α. Both are positive regulators of FGF23, leading to the conclusion, that cellular stress might regulate FGF23 via HIF1α or oxidative stress. FGF23 excess results in increased bone resorption and suppressed bone formation. Likewise, also chemotherapeutic drugs and serum deficiency reduce bone density. Therefore, the stimulation of FGF23 may cause or further stimulate bone resorption. In paper 2, the influence of the cytostatic drugs cisplatin, paclitaxel, and doxorubicin as well as apoptosis inductors PAC-1 or serum depletion on αklotho expression in renal MDCK, NRK-52E, and HK-2 cells has been investigated. In fact, all cytotoxic compounds stimulated gene expression of αklotho while decreasing cell proliferation and viability. By using a combined apoptosis and necrosis assay, we confirmed the induction of apoptosis but also necrosis to a variable extent. Additionally, the transcriptional regulation of apoptotic proteins of the BCL-2 family was assessed and confirmed apoptosis stimulation. Transcription factor PPARγ is a known positive regulator of αklotho. In MDCK cells, we detected a significant influence of cisplatin-mediated stimulation of PPARγ mRNA on the αklotho increase. Furthermore, cisplatin, doxorubicin, PAC-1, and serum deprivation also up-regulated FGFR production in MDCK cells. In cancer cells, overexpression of FGFR is associated with enhanced resistance against chemotherapeutic drugs. Consequently, αklotho and FGFR1 stimulation may be a protective mechanism to prevent hyperphosphatemia during diseases. However, human HK-2 cells treated with cisplatin, paclitaxel, doxorubicin, or serum depletion significantly down-regulated αklotho expression and protein secretion. PAC-1 did not change the expression or production of αklotho in HK-2 cells, which might be explained by the minor effect of PAC-1 on non-carcinogenic cells lacking an overexpression of procaspase-3. The differential regulation of αklotho in MDCK and NRK-52E versus HK-2 cells by cytotoxic stress might have numerous causes. For instance, there is evidence of an increased sensitivity of HK-2 cells to stress stimuli but a better comparability to the animal model. However, immortalized cell lines can not completely reflect the conditions of native tissue especially with regard to cell death. Furthermore, the species, sex or age of the donor organism as well as passage number of the cells and drug transporter expression might impact αklotho regulation. Additionally, the mode of cell death determined by intracellular ATP homeostasis and its regulation of AMPK might play an important role in αklotho regulation. However, all these theories need to be further addressed. In summary, inflammation, ROS formation, or the activation of HIF1α are all reported to correlate in a negative manner with αklotho production or serum levels. αklotho down-regulation may be a tool to increase cell proliferation or prevent hypophosphatemia. In contrast, AMPK activation by intracellular ATP restriction may positively regulate αklotho to promote cell protection and avoid hyperphosphatemia.Zellulärer Stress ist definiert als eine Beeinflussung der regulären Zellfunktion durch innere oder äußere Einflüsse wie kritische Temperaturen, Energiedefizite, Infektionen, mechanische Verletzungen oder chemische Noxen. Die vorliegende Arbeit dient dem Ziel, den Einfluss von zellulärem Stress auf die Expression von FGF23 und αKlotho zu untersuchen. FGF23 ist ein vorwiegend im Knochen produziertes Hormon, dass in der Niere die Phosphatausscheidung reguliert. Durch Bindung an den Komplex aus FGF Rezeptor und Ko-Rezeptor αKlotho wird die Rückresorption von Phosphat aus dem Tubuluslumen reduziert. Außerdem senkt FGF23 die Produktion von 1,25(OH)2D3, dem aktiven Vitamin D, und erhöht gleichzeitig dessen Abbau. 1,25(OH)2D3 reguliert im Dünndarm die Resorption von Phosphat. Durch die Wirkung von FGF23 wird also zusätzlich weniger Phosphat aus der Nahrung aufgenommen. Chronisch erhöhte FGF23-Serumkonzentrationen sind mit Erkrankungen wie renalen oder kardiovaskulären Erkrankungen assoziiert. αKlotho hat neben der Funktion als Ko-Rezeptor für FGF23 noch weitere, FGF23-unabhängige Wirkungen. Es wurde ursprünglich als anti-Alterungshormon entdeckt, da eine loss-of-function Mutation im αKlotho-Gen zahlreiche altersassoziierte Probleme wie massive Kalziumablagerungen in Geweben und Blutgefäßen, Osteoporose, Sterilität und eine frühe Sterblichkeit hervorruft. Im Rahmen der beiden Veröffentlichungen wurde untersucht, inwiefern die Zytostatika Cisplatin, Doxorubicin und Paclitaxel, sowie die Apoptoseinduktion durch PAC-1 oder Serumentzug die Regulation von FGF23 und αKlotho beeinflussen. In UMR106, einer osteoblastenähnlichen Osteosarkom-Zelllinie wurde durch eine 24- oder teilweise 48-stündige Behandlung mit Cisplatin, Doxorubicin, PAC-1 und durch Serumreduktion oder –Entzug die FGF23-Expression signifikant stimuliert. Gleichzeitig sanken die Viabilität und Proliferation der Zellen. Mittels Serumentzug konnte zusätzlich die Erhöhung der FGF23-Proteinkonzentration im Überstand gezeigt werden. Parallel zu FGF23 wurde die Expression des pro-inflammatorischen Zytokins IL6 durch Cisplatin und Doxorubicin erhöht und die Hemmung des IL-6 Membranrezeptors gp130 zeigte, dass die Stimulation von FGF23 zumindest zu einem Teil durch IL-6 vermittelt wurde. Andere Arbeitsgruppen konnten bereits vorher zeigen, dass IL-6 und andere pro-inflammatorische Zytokine und Entzündungsmediatoren wie TNFα, TGF-β oder IL-1β die Genexpression und Synthese von FGF23 stimulieren. Außerdem werden entzündliche Erkrankungen wie rheumatoide Arthritis, CKD oder chronisch-entzündliche Darmerkrankungen mit erhöhten FGF23 Serumkonzentrationen assoziiert. In diesem Zusammenhang wurde zusätzlich die Expression und Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB untersucht, der zahlreiche Entzündungsfaktoren reguliert. Cisplatin und Doxorubicin steigerten die Genexpression der NFκB Untereinheit Rela und Cisplatin wurde erhöhte zusätzlich die Phosphorylierung von NFκB in UMR106 Zellen. Die NFκB-Inhibitoren Wogonin und Witheraferin A konnten separat voneinander die Stimulation von FGF23 durch Cisplatin unterbinden, was zeigte, dass die FGF23-Stimulation teilweise auf einer Aktivierung von NFκB beruhte. Die Versuche zeigten einen starken Einfluss von Entzündungsprozessen auf die FGF23-Stimulation durch Cisplatin und Doxorubicin. PAC-1 und Serumentzug induzieren direkt eine Apoptose, die üblicherweise nicht mit Entzündungsprozessen einhergeht. Mögliche Faktoren, die im Zuge der Apoptose durch alle verwendeten Substanzen beeinflusst werden, sind die Bildung von ROS und die Aktivierung von HIF1α. Beides sind bekannte Regulatoren von FGF23. Insofern könnten apoptotische Zellen über HIF1α oder oxidativen Stress die Bildung von FGF23 anregen. Als Konsequenz der FGF23-Steigerung wird die Knochenbildung unterdrückt und vermehrt Knochenmasse abgebaut. Dementsprechend sind auch Chemotherapeutika und Serumentzug Faktoren, die für eine Reduktion der Knochenmasse bekannt sind. Wie in Veröffentlichung 1 gezeigt, könnte dies durch die Stimulation von FGF23 mitverursacht oder verstärkt werden. In der zweiten Veröffentlichung wurde der Einfluss der Chemotherapeutika Cisplatin, Paclitaxel und Doxorubicin sowie der Apoptoseinduktoren PAC-1 und Serumentzug auf αKlotho in renalen MDCK, NRK-52E und HK-2 Zellen untersucht. In MDCK- und NRK-Zellen stimulierten alle zytotoxischen Substanzen die Genexpression von αKlotho und beeinträchtigten gleichzeitig die Zellproliferation und –viabilität. Mittels kombiniertem Apoptose-Nekrose-Test wurde die Induktion von Apoptose aber teilweise auch Nekrose nachgewiesen. Zusätzlich bestätigte die transkriptionelle Stimulation von apoptotischen Proteinen der BCL-2 Familie die Induktion der Apoptose. Ein bekannter Positivregulator von αKlotho ist der Transkriptionsfaktor PPARγ. Diesem konnte in MDCK-Zellen ein signifikanter Einfluss auf die Genexpression von αKlotho durch Cisplatin nachgewiesen werden. Parallel zu αKlotho wurde auch die Produktion von FGFR1 durch Cisplatin, Doxorubicin, PAC-1 und Serumentzug in MDCK-Zellen stimuliert. Die Hochregulierung von FGFR1 ist in Krebszellen mit einer verstärkten Resistenz gegenüber Chemotherapeutika assoziiert und deutet folglich auf einen protektiven Mechanismus hin. In menschlichen HK-2 Zellen wurde die Genexpression und Proteinsekretion von αKlotho durch die Behandlung mit Cisplatin, Paclitaxel, Doxorubicin und Serumenzug überraschenderweise verringert. PAC-1 zeigte keinen Effekt auf die HK-2-Zellen, was vermutlich durch eine geringe Wirkung von PAC-1 auf nicht-kanzerogene Zellen durch die fehlende Überregulation von Procaspase-3 herrührt. Die unterschiedliche Regulation von αKlotho in MDCK-, NRK- und HK-2-Zellen durch zytotoxischen Stress kann zahlreiche Ursachen haben. Zum Einen gibt es Hinweise auf eine erhöhte Sensibilität der HK-2-Zellen und eine bessere Vergleichbarkeit zum Tiermodell. Allerdings können immortalisierte Zellen die Bedingungen in nativen Geweben nur teilweise reflektieren, besonders in Hinblick auf den Zelltod. Desweiteren kann auch die Spezies, das Geschlecht oder Alter des Spenderorganismus, beziehungsweise die Anzahl der Passagen der Zellkultur eine Rolle bei der Expression der Medikamententransporter spielen und somit Einfluss auf αKlotho nehmen. Außerdem könnte die Form des Zelltods, die durch den ATP-Haushalt der Zelle und die Regulation von AMPK bestimmt wird, αKlotho beeinflussen. Entzündung, die Bildung von ROS sowie die Aktivierung von HIF1α korrelieren alle in negativer Weise mit der renalen αKlotho Produktion bzw. Serumkonzentrationen. Die Herunterregulierung von αKlotho könnte zur Förderung der Zellproliferation beitragen oder eine Hypophosphatämie verhindern. Eine Hochregulierung von αKlotho könnte dem Schutz der Zellfunktion bzw. der Vermeidung einer Hyperphosphatämie dienen.enghttp://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.phpInflammationOxidative stressPhosphateRenal diseaseInflammationOxidativer StressPhosphatVitamin D570Vitamin DDoctoralThesis1873114567urn:nbn:de:bsz:100-opus-22521