cc_by-nc-ndcc_by-nc-ndKuhn, AndreasStiegler, Natalie2024-04-082024-04-082011-06-302011https://hohpublica.uni-hohenheim.de/handle/123456789/5489Translocation of proteins across or into the cytoplasmic membrane of Escherichia coli is accomplished by several mechanisms. The cellular secretion machinery, the translocase SecYEG, mediates the transport of unfolded proteins into the periplasm with the help of the ATPase SecA or passes the membrane proteins for bilayer integration to the insertase YidC. Membrane insertion is catalysed by YidC, whereby the native conformation of the proteins in the lipid bilayer is achieved. The translocation of a few membrane proteins occurs Sec-independently solely with the help of the insertase YidC. One of these Sec-independent proteins is the major capsid protein of the bacteriophage M13. This protein is inserted as preprotein, termed M13 procoat, with the orientation Nin-Cin into the inner membrane and a central loop domain located in the periplasm. This process is catalysed by the electrochemical membrane potential and YidC. M13 procoat is then processed by the leader peptidase to its mature form, M13 coat (orientation Nout-Cin). In the present thesis an analysis of the different transport systems of the inner membrane is performed using the example of the M13 procoat protein and its mutants. One mutant is the procoat H5EE which has 2 additional acidic residues introduced between residues +2 and +3. The insertion of this mutant requires the Sec translocase and strictly depends on the electrochemical potential. Membrane insertion of M13 procoat and derived proteins into the cytoplasmic membrane was followed in an in vitro reconstitution and translocation system. Therefore, all components of the Sec translocase (SecYEG and SecA), the insertase YidC and the different procoat proteins were purified and tested with the in vitro translocation system. Reconstitution of YidC into phospholipid vesicles depended on the lipid composition for its orientation. The cytoplasmic-out orientation corresponds to the active topology in E. coli where both termini are located in the cytoplasm. Certain lipid compositions caused the inversed orientation, which affected the catalytic activity of the reconstituted insertase. The procoat mutants H5 und H5EE were membrane inserted only in the presence of reconstituted YidC. Both proteins inserted efficiently into the vesicles with the periplasmic loop in the interior of the vesicles like the mutant PClep of procoat H5 with the C-terminal extension of the leader peptidase. Spontaneous insertion of H5 und H5EE into liposomes occurred only into leaky vesicles of the E. coli lipids. The membrane integrity was improved by the addition of an adequate amount of diacylglycerol (DAG) to the phospholipids. The leaky phospholipids were sealed by the addition of 3-4% DAG. The proteins H5 und H5EE showed a dependency of the membrane potential. Insertion occured more efficiently into YidC proteoliposomes when a stable membrane potential was generated. Proteoliposomes with reconstituted SecYEG translocase were also tested for protein insertion. Remarkedly, the protein M13 procoat H5EE efficiently inserted into SecYEG proteoliposomes, where the wildtype-like protein H5 did not.Die Translokation von Proteinen über und in die Cytoplasmamembran von Escherichia coli kann über verschiedene Mechanismen bewerkstelligt werden. Die zelluläre Sekretionsmaschinerie, die Translokase SecYEG, transportiert mithilfe der ATPase SecA große ungefaltete Proteine ins Periplasma oder leitet Membranproteine an die Insertase YidC weiter. Die Membraninsertion wird von YidC katalysiert, wodurch die native Konformation der Proteine in der Lipid-doppelschicht erreicht wird. Die Translokation einiger weniger Membranproteine verläuft Sec-unabhängig nur mithilfe der Insertase YidC. Eines dieser Sec-unabhängigen Proteine stellt das Haupthüllprotein des Bakteriophagens M13 dar. Dieses Protein wird als Präprotein, genannt M13 procoat, mit der Orientierung Nin-Cin in die innere Membran inseriert und besitzt eine zentrale Loop-Domäne im Periplasma. Dieser Vorgang wird vom elektrochemischen Membran-potential und YidC katalysiert. Anschließend wird das M13 procoat durch die Leaderpeptidase zu seiner maturen Form, M13 coat (Orientierung Nout-Cin), prozessiert. Die vorliegende Arbeit befasst sich anhand des Modellproteins M13 procoat und M13 procoat-Mutanten mit der Analyse der verschiedenen Transportsysteme der inneren Membran. Eine Mutante ist das Procoat H5EE, welches zwei zusätzliche saure Aminosäurereste zwischen Position +2 und +3 besitzt. Die Insertion dieser Mutante benötigt die Sec-Translokase und ist strikt vom Membranpotential abhängig. Die Membraninsertion von M13 procoat und abgeleiteten Proteinen in die cytoplasmatische Membran wurde in einem in vitro-Rekonstitutions- und Translokationssystem untersucht. Hierfür wurden die einzelnen Komponenten der Sec-Translokase (SecYEG und SecA), die Insertase YidC, sowie die verschiedenen Procoatproteine gereinigt und in dem in vitro-Translokationssystem eingesetzt. Die Rekonstitution von YidC in Phospholipidvesikel erfolgte abhängig von der Lipid-zusammensetzung der Membran. Die cytoplasmic-out-Orientierung entspricht der aktiven Topologie in E. coli mit den Termini im Cytoplasma. Einige Lipidkompositionen verursachten die Inversion der Orientierung, wodurch die katalytische Aktivität der Insertase beeinträchtigt wurde. Die Procoatmutanten H5 und H5EE wurden nur in Anwesenheit von rekonstituiertem YidC in die Membran inseriert. Beide Proteine inserierten effizient in die Vesikel mit den Termini nach außen und dem periplasmatischen Loop im Inneren der Vesikel, wie die Mutante PClep von Procoat H5 mit dem C-terminalen Teil der Leaderpeptidase. Spontaninsertion in Liposomen fand nur in undichte Vesikel aus E. coli Lipiden statt. Die Membranintegrität konnte durch die Zugabe einer ausreichenden Menge an Diacylglycerin (DAG) zu den Phospholipiden verhindert werden. Undichte Phospholipide konnten durch das Zufügen von 3-4% DAG repariert werden. Die Proteine H5 und H5EE zeigten auch in vitro eine Abhängigkeit vom Membranpotential. Sie wurden effizienter in YidC-Proteoliposomen inseriert, wenn ein stabiles Membranpotential vorhanden war. Proteoliposomen mit rekonstituierter SecYEG-Translokase wurden ebenfalls auf Proteininsertion getestet. Erstaunlicherweise inserierte das Protein M13 procoat H5EE effizient in SecYEG-Proteoliposomen, nicht aber das wildtypische H5-Protein.gerMembrane insertionReconstitutionM13 procoatYidCSecYEGLiposomesMembraninsertionM13 procoatYidCSecYEGLiposomen570RekonstitutionDoctoralThesis346674654urn:nbn:de:bsz:100-opus-6086