publ-ohne-podpubl-ohne-podFritz-Steuber, JuliaSchleicher, Lena2024-04-082024-04-082022-06-032022https://hohpublica.uni-hohenheim.de/handle/123456789/6730Members of the family Prevotellaceae are Gram-negative, obligate anaerobic bacteria found in animal and human microbiomes, where they participate in the degradation of carbohydrates and peptides. Some Prevotella species are also opportunistic pathogens. In this study, growth requirements and central catabolic reactions of two different Prevotella strains were characterized. First, the energy conservation by Prevotella bryantii was analyzed. P. bryantii is a dominant species in the ruminal microbiome. It was demonstrated, that P. bryantii ferments glucose mainly to acetate and succinate. Furthermore, enzymatic and biochemical studies revealed that P. bryantii membranes harbor fully functional Na+ -translocating NADH:quinone oxidoreductase and quinol:fumarate reductase. It was shown, that electron transfer between these two enzymes occurs in native membranes. The enzymatic activities increased significantly by anoxic membrane preparations. Electron transfer in membrane vesicles was coupled to the build-up of a sodium motive force in P. bryantii. A respiratory chain composed of NQR and QFR in P. bryantii was proposed, which links succinate formation to NADH oxidation and SMF formation. Thus, P. bryantii does not rely solely on substrate-level phosphorylation for energy conservation, but gains additional energy utilizing the Na+-pump, NQR. This increases the overall yield of ATP per consumed glucose molecule. By gel electrophoresis and size exclusion chromatography, the existence of a supercomplex composed of NQR and QFR in P. bryantii membranes was demonstrated, which operates as sodium-translocating NADH:fumarate oxidoreductase. The understanding of the catabolic reactions in the rumen by the ruminal microbiota is important for the optimal nutrition of the ruminant. Our results indicate that P. bryantii plays an important role in the ruminal microbiota. P. bryantii extrudes mainly acetate and succinate as fermentative end-products into the rumen. The latter can be used by other organisms of the ruminal microbiome to metabolize propionate, which is an important nutrient for the ruminant since it enters the pathway of gluconeogenesis, yielding glucose. Prevotella bivia is considered to act as causative agent of human bacterial vaginosis. Growth of P. bivia on glucose was dependent on CO2 and resulted in the production of succinate, malate and acetate. With the help of optical spectroscopy and enzymatic measurements, the presence and activity of NQR and QFR in P. bivia were demonstrated. Electron transfer in membrane vesicles of P. bivia resulted in the build-up of a SMF. Similar to P. bryantii, P. bivia operates NQR and QFR for energy conservation in its membrane, resulting in succinate formation and SMF generation. P. bivia also exhibits high L-asparaginase and aspartate ammonia lyase activities in vitro, catalyzing the conversion of L-asparagine to fumarate and NH4+. These results were confirmed in vivo by growth experiments. Additional L-asparagine in the growth medium led to an elevated production of NH4+ and succinate from fumarate obtained during degradation of L-asparagine. At the same time an inhibitory effect of NH4+ on growth of P. bivia was observed. It is proposed, that amino acid degradation by P. bivia in microbial consortia associated with BV depends on the consumption of ammonium by Gardnerella vaginalis, another typical pathogen found in BV. At the same time, G. vaginalis could provide L-asparagine to P. bivia, strengthening their symbiotic relationship and triggering BVMitglieder der Familie Prevotellaceae sind Gram-negative, obligat anaerobe Bakterien, die in tierischen und menschlichen Mikrobiomen vorkommen. Dort sind sie am Abbau von Kohlenhydraten und Peptiden beteiligt. Einige Prevotella Spezies sind auch opportunistische Krankheitserreger. In dieser Studie wurden zwei Prevotella Stämme hinsichtlich ihrer Wachstumsbedingungen und der zentralen katabolischen Reaktionen charakterisiert. Zuerst wurde die Energiekonservierung von Prevotella bryantii untersucht, eine vorherrschende Spezies im Mikrobiom des Pansens. Es wurde gezeigt, dass P. bryantii Glukose hauptsächlich zu Acetat und Succinat fermentiert. Außerdem zeigten enzymatische und biochemische Studien, dass Membranen von P. bryantii funktionsfähige Na+ -translozierende NADH:Chinon Oxidoreduktase und Chinol:Fumarat Reduktase besitzen. Es wurde gezeigt, dass zwischen diesen beiden Enzymen Elektronentransport in nativen Membranen stattfindet. Die enzymatischen Aktivitäten konnten signifikant durch anoxische Membranpräparation gesteigert werden (Kapitel 2). Dieser Elektronentransport in nativen Membranen ist an den Aufbau eines elektrochemischen Natriumgradienten in P. bryantii gekoppelt. Diese Ergebnisse führen zu der begründeten Hypothese, dass eine Atmungskette bestehend aus NQR und QFR unter Oxidation von NADH und Bildung von Succinat zur Erzeugung eines elektrochemischen Natriumgradienten in P. bryantii beiträgt. Folglich beruht die Energiekonservierung von P. bryantii nicht ausschließlich auf Substratkettenphosphorylierung, denn durch die Nutzung der Na+ -Pumpe, NQR, wird zusätzlich Energie generiert. Dadurch erhöht sich die Ausbeute an ATP pro konsumiertem Glukosemolekül. Durch Gel-Elektrophorese und Größenausschluss-Chromatographie wurde ein Superkomplexes (bestehend aus NQR und QFR) nachgewiesen, welcher als Natrium-translozierende NADH:Fumarat Oxidoreduktase arbeitet. Das Verständnis für die katabolen Reaktionen des Mikrobioms im Pansen ist wichtig für die optimale Ernährung des Wiederkäuers. Unsere Ergebnisse lassen vermuten, dass P. bryantii eine wichtige Rolle im Pansenmikrobiom spielt. P. bryantii gibt vor allem Acetat und Succinat als fermentative Endprodukte in den Pansen ab. Diese Fermentationsprodukte werden von anderen Organismen des Pansenmikrobioms benutzt, um Propionat zu bilden. Dies ist ein wichtiger Nährstoff für den Wiederkäuer, da Propionat in der Glukoneogenese verwendet wird. Man nimmt an, dass Prevotella bivia ein Krankheitserreger der bakteriellen Vaginose ist. Das Wachstum von P. bivia auf Glukose war CO2-abhängig und führte zur Produktion von Succinat und Acetat. Mit Hilfe von optischer Spektroskopie und enzymatischen Messungen konnte die Anwesenheit und Aktivität der NQR und QFR in der Membran von P. bivia nachgewiesen werden. Der Elektronentransport in Membranvesikeln von P. bivia führte zu dem Aufbau eines elektrochemischen Natriumgradienten. Folglich sind in P. bivia, ähnlich zur Situation in P. bryantii, die NQR und QFR an der Energiekonservierung beteiligt, wobei Succinat und Acetat gebildet werden. Des Weiteren zeigt P. bivia hohe L-Asparaginase und Aspartat-Ammonium-Lyase Aktivitäten in vitro, was zur Umwandlung von Asparagin zu Fumarat und NH4+ führt. Diese Ergebnisse wurden in Wachstumsexperimenten in vivo bestätigt. Zusätzliches L-Asparagin im Wachstumsmedium führte zu einer erhöhten Produktion von NH4+ und Succinat. Dieses Succinat wurde aus Fumarat gebildet, welches durch den Abbau von L-Asparagin entstand. Gleichzeitig wurde ein inhibitorischer Effekt von NH4+ auf das Wachstum von P. bivia beobachtet. Die Studien legen den Schluss nahe, dass der Aminosäureabbau durch P. bivia in dem mikrobiellen Konsortium einer BV nur durch Gardnerella vaginalis ermöglicht wird, der das durch P. bivia freigesetzte Ammonium kontinuierlich verwendet. Gleichzeitig stellt G. vaginalis L-Asparagin für P. bivia bereit und stärkt so ihre symbiontische Beziehung, die maßgeblich für die Ausbildung der BV ist.enghttp://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.phpNa+-translocating NADH:quinone oxidoreductaseFumarate reductasePrevotella spp.Anaerobic respirationSupercomplex570DoctoralThesis1806134535urn:nbn:de:bsz:100-opus-20388