cc_by-nccc_by-ncKuhn, AndreasImhof, Nora2024-04-082024-04-082011-12-012011https://hohpublica.uni-hohenheim.de/handle/123456789/5539The membrane insertase YidC of the Gram-negative bacterium E. coli enables the insertion of proteins into the cytoplasmic membrane. YidC itself is localized in the cytoplasmic membrane and spans the membrane six times with its N- and C-termini localized in the cytoplasm. These six transmembrane segments are connected by three periplasmic loops (P1, P2 and P3) and two cytoplasmic loops (C1 and C2). It is known that the binding of the YidC-dependent protein Pf3 coat induces conformational changes in the tertiary structure of YidC. This molecular dynamic of YidC was examined in detail with steady-state and time-resolved fluorescence spectroscopy. Therefore, three tryptophan mutants of YidC with one tryptophan residue each, at position 354 in the first periplasmic domain P1, at position 454 in the second periplasmic region and at position 508 near the third periplasmic region, respectively, were used. Additionally, a double tryptophan mutant was used which contained two tryptophan residues at position 332/334 of the domain P1. These tryptophan residues were used as intrinsic fluorophores. First, it was shown that the tryptophan mutants of YidC complemented the growth defect of the E. coli YidC-depletion strain JS7131. Additionally, the mutants were able to insert the strictly YidC-dependent PClep protein into the cytoplasmic membrane of the depletion strain. Thus, the functionality of the tryptophan mutants of YidC was ensured. Purified tryptophan mutants of YidC were reconstituted into liposomes and titrated with Pf3W0 coat, a tryptophan free mutant of Pf3 coat protein allowing spectroscopic studies of each periplasmic region (P1, P2 and P3) before and after binding of Pf3W0 coat protein. Analysis of the emission spectra and the fluorescence lifetimes of detergent solubilized as well as of the reconstituted YidC tryptophan mutants before binding of Pf3W0 coat revealed that the tryptophan residue of each single tryptophan mutant (YidCW354, YidCW454 and YidCW508) was localized at the membrane/water interface. These results are consistent with the proposed membrane topology of YidC. The tryptophan residues of the double tryptophan mutant of YidC (YidC2W) showed fluorescence properties consistent with their localization in a partially exposed alpha-helical segment of the P1 domain. Analysis of the emission spectra and the fluorescence lifetimes provided additional evidence that binding of Pf3W0 coat induced conformational changes of all periplasmic regions (P1, P2 and P3) within YidC. Measurements of fluorescence anisotropy showed that the conformational changes affected motions within all three periplasmic regions of the YidC tryptophan mutants, whereas the periplasmic domain P1 with the tryptophan residues W332/W334 and the third periplasmic domain P3 with the tryptophan residue W508 were affected most significantly.Die YidC-Insertase des Gram-negativen Bakteriums E. coli ermöglicht die Insertion von Proteinen in die Cytoplasmamembran. YidC selbst ist ebenfalls in der Cytoplasmamembran lokalisiert und durchspannt diese mit sechs Transmembrandomänen. Dabei sind der N- und der C-Terminus im Cytoplasma lokalisiert. Die sechs Transmembrandomänen werden durch drei periplasmatische Bereiche (P1, P2 und P3) und zwei im Cytoplasma lokalisierte Bereiche(C1 und C2) verbunden. Es ist bekannt, dass durch die Bindung des YidC-abhängigen Proteins Pf3 coat Konformationsänderungen in der Tertiärstruktur von YidC verursacht werden. Diese molekulare Dynamik von YidC wurde in dieser Arbeit mittels ?steady-state? und zeitaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie genauer untersucht. Dafür wurden drei YidC-Tryptophanmutanten verwendet, die an Position 354 in der ersten periplasmatischen Domäne P1, an Position 454 im zweiten periplasmatischen Bereich P2 bzw. an Position 508 nahe des dritten periplasmatischen Bereichs P3 jeweils einen Tryptophan-Rest enthielten. Zusätzlich wurde eine Doppel-Tryptophanmutante verwendet, die zwei Tryptophan-Reste in der P1-Domäne an Position 332/334 enthielt. Diese Tryptophan-Reste dienten als intrinsische Fluorophore. Zunächst wurde gezeigt, dass die YidC-Tryptophanmutanten den Wachstumsdefekt des E. coli YidC-Depletionsstammes JS7131 komplementieren konnten und zudem in der Lage waren, das strikt von YidC abhängige Protein PClep in die Cytoplasmamembran des Depletionsstammes zu inserieren. Dies stellte sicher, dass die YidC-Tryptophanmutanten funktionell waren. Die gereinigten YidC-Tryptophanmutanten wurden in Liposomen rekonstituiert und mit Pf3W0 coat, einer Tryptophan-freien Mutante von Pf3 coat, titriert. Dies ermöglichte spektroskopische Untersuchungen jedes einzelnen periplasmatischen Bereichs (P1, P2 und P3) von YidC vor und nach Bindung von Pf3W0 coat Protein. Analysen der Emissionsspektren und der Fluoreszenz-Lebensdauern der Detergenz-solubilisierten sowie der rekonstituierten YidC-Tryptophanmutanten vor Bindung von Pf3 coat ließen darauf schließen, dass sich der jeweilige Tryptophan-Rest der Einzel-Tryptophanmutanten (YidCW354, YidCW454 und YidCW508) in der Grenzschicht von Wasser und Membran befand. Diese Ergebnisse sind vereinbar mit der bisher bekannten Membrantopologie von YidC. Die Tryptophan-Reste der Doppel-Tryptophanmutante (YidC2W) wiesen Fluoreszenzeigenschaften auf, die in Einklang mit der bekannten Struktur der P1-Domäne stehen, wonach sie sich in einem teilweise zugänglichen, alpha-helikalen Bereich befinden. Die Analyse der Emissionsspektren und der Fluoreszenz-Lebensdauern führten des Weiteren zur Erkenntnis, dass durch Bindung des Pf3W0 coat Proteins Konformationsänderungen in allen drei periplasmatischen Bereichen (P1, P2 und P3) von YidC stattfanden. Anisotropie-Messungen zeigten, dass diese Konformationsänderungen zu Bewegungen der Tryptophan-Reste in allen drei periplasmatischen Bereichen der YidC-Tryptophanmutanten führten, wobei die periplasmatische Domäne P1 mit den Tryptophan-Resten W332/W334 und der dritte periplasmatische Bereich P3 mit dem Tryptophan-Rest W508 am signifikantesten betroffen waren.gerYidCPf3 coatTryptophanLiposomesEscherichia coliYidCPf3 coatTryptophanLiposomenEscherichia coli570RekonstitutionFluoreszenzspektroskopieDoctoralThesis354037412urn:nbn:de:bsz:100-opus-6595