cc_by-nc-ndcc_by-nc-ndDittmann, KlausAmpferl, Rena2024-04-082024-04-082018-08-292018https://hohpublica.uni-hohenheim.de/handle/123456789/6292Radiotherapy is a major pillar of cancer treatment. However, the maximal dose that can be applied to a tumor is limited by side-effects of the irradiated normal tissue. Therefore, to improve treatment success, it is of significant interest to develop new treatment strategies that selectively enhance the cytotoxic effect of radiation in tumor cells while sparing healthy tissue. For this purpose, it is necessary to exploit differences between tumor cells and normal cells. Thus, tumor cells are characterized by metabolizing glucose preferentially to lactate regardless of the availability of oxygen (Warburg effect, aerobic glycolysis), while normal cells oxidize most of the glucose in the mitochondria if oxygen is present. Because the Warburg effect only produces low amounts of ATP per molecule of glucose when compared to mitochondrial glucose oxidation, tumor cells rely on high glucose supply. Hence, it was the aim of this study to investigate whether a glucose starvation during radiotherapy, which requires energy-dependent repair of DNA damage, is an appropriate strategy to selectively enhance radiosensitivity of tumor cells, but not of normal cells. It was shown that glucose starvation inhibited proliferation of the tumor cell lines A549 and FaDu, but not that of the normal fibroblasts HSF7. Moreover, deprivation of glucose induced cell death selectively in tumor cells, which occurred mainly via necrosis. Combining glucose starvation with radiotherapy led to selective radiosensitization of both tumor cell lines, which was accompanied by impaired repair of radiation-induced DNA double-strand breaks (DNA DSBs). In this context, it turned out that in tumor cells glucose is essential for the late stage of DNA DSB repair starting from 13 h after irradiation. Furthermore, an inhibition of radiation-induced histone acetylation as well as KAP1 phosphorylation could be observed in tumor cells following glucose starvation, indicating an impairment of radiation-induced chromatin relaxation. Because opening of the chromatin structure is particularly important for the repair of DNA DSBs within heterochromatin and because these DSBs are the ones that are repaired at late time points after irradiation, it can be assumed that in tumor cells glucose starvation mainly impairs the repair of heterochromatic DNA DSBs. Further investigations revealed that in tumor cells glucose starvation does not cause lack of nuclear acetyl-CoA, which is the substrate for the acetylation of histones, and therefore this could be excluded as cause of the observed inhibition of histone acetylation. However, it is known that the histone deacetylase Sirt1 is activated in response to glucose starvation. Histone deacetylation by Sirt1 could counteract radiation-induced histone acetylation, thus impairing chromatin relaxation as well as repair of DNA DSBs after irradiation. In fact, it was shown that inhibition of Sirt1 by sirtinol can partly abrogate the impaired repair of radiation-induced DNA DSBs that was observed in tumor cells under glucose-free conditions. However, the inhibitory effect of glucose starvation on DNA DSB repair in tumor cells could not only be observed under glucose-free conditions. Thus, reducing the glucose concentration to 0.5 g/l was enough to impair DSB repair following irradiation to the same degree as after total deprivation of glucose. Furthermore, it turned out that under glucose-free conditions DNA DSB repair in tumor cells was promoted by autophagy already after irradiation with 2 Gy. Finally, it was shown that, in addition to DNA DSB repair, also tumor metabolism is influenced by glucose starvation. Thus, deprivation of glucose impaired the radiation-induced switch of glucose metabolism that was characterized by increased aerobic glycolysis and decreased mitochondrial glucose oxidation, and this can also contribute to radiosensitization of the cells. In contrast to tumor cells, glucose starvation neither caused radiosensitization nor impaired the repair of radiation-induced DNA DSBs in normal fibroblasts. Moreover, in these cells, glucose starvation had no influence on histone acetylation and KAP1 phosphorylation after irradiation. These results demonstrate that glucose starvation is an appropriate in vitro strategy to selectively sensitize tumor cells to radiotherapy without influencing the radiosensitivity of normal cells.Die Strahlentherapie stellt eine zentrale Säule bei der Behandlung von Krebs dar. Die maximale Dosis, mit der ein Tumor bestrahlt werden kann, wird jedoch durch Nebenwirkungen des mitbestrahlten Normalgewebes begrenzt. Um den Behandlungserfolg zu verbessern, ist es somit von wesentlichem Interesse, neue Therapiestrategien zu entwickeln, die gezielt die zellschädigende Wirkung der Strahlung auf den Tumor verstärken, während das gesunde Gewebe geschont wird. Dabei gilt es, Unterschiede zwischen Tumorzellen und normalen Zellen zu nutzen. So ist es ein charakteristisches Merkmal von Tumorzellen, Glukose unabhängig von der vorherrschenden Sauerstoffkonzentration überwiegend zu Laktat zu verstoffwechseln (Warburg-Effekt, aerobe Glykolyse), während normale Zellen bei Anwesenheit von Sauerstoff die meiste Glukose in den Mitochondrien oxidieren. Da der Warburg-Effekt im Vergleich zur mitochondrialen Glukoseoxidation jedoch mit einer geringen ATP-Ausbeute pro Molekül Glukose einhergeht, sind Tumorzellen auf eine hohe Glukosezufuhr angewiesen. Daher war es Ziel dieser Arbeit zu untersuchen, ob ein Glukoseentzug im Rahmen der Strahlentherapie, die eine energieaufwendige Reparatur von DNA-Schäden erfordert, eine geeignete Strategie darstellt, um selektiv die Strahlenempfindlichkeit von Tumorzellen, nicht jedoch von normalen Zellen, zu erhöhen. Es zeigte sich, dass ein Glukoseentzug die Proliferation der Tumorzelllinien A549 und FaDu, nicht jedoch der normalen Fibroblasten HSF7, hemmte. Zudem führte der Entzug von Glukose selektiv bei den Tumorzellen zum Zelltod, wobei dieser hauptsächlich durch Nekrose erfolgte. Wurde der Glukoseentzug mit einer Strahlenbehandlung kombiniert, so konnte eine selektive Radiosensitivierung der beiden Tumorzelllinien erzielt werden, welche mit einer beeinträchtigten Reparatur strahleninduzierter DNA-Doppelstrangbrüche (DNA-DSBs) einherging. Dabei stellte sich heraus, dass die Glukose in Tumorzellen für die späte Phase der DNA-DSB-Reparatur, beginnend ab 13 h nach der Bestrahlung, essentiell ist. Des Weiteren konnte in den Tumorzellen eine Hemmung der strahleninduzierten Histonacetylierung sowie KAP1-Phosphorylierung infolge des Glukoseentzugs beobachtet werden, welche auf eine Beeinträchtigung der strahleninduzierten Chromatinrelaxation schließen ließ. Da die Öffnung der Chromatinstruktur besonders für die Reparatur von DNA-DSBs innerhalb des Heterochromatins von Bedeutung ist und gerade diese DSBs zu späten Zeitpunkten nach der Bestrahlung repariert werden, ist zu vermuten, dass in Tumorzellen durch den Glukoseentzug vor allem die Reparatur heterochromatischer DNA-DSBs beeinträchtigt wird. Weitere Untersuchungen ergaben, dass ein Glukoseentzug in Tumorzellen keinen Mangel an nukleärem Acetyl-CoA, dem Substrat für die Acetylierung von Histonen, verursacht, weshalb dies als Grund für die beobachtete Hemmung der Histonacetylierung ausgeschlossen werden konnte. Es ist jedoch bekannt, dass die Histondeacetylase Sirt1 infolge eines Glukoseentzugs aktiviert wird. Die Sirt1-vermittelte Histondeacetylierung könnte der strahleninduzierten Histonacetylierung entgegenwirken und somit die Chromatinrelaxation und damit auch die Reparatur von DNA-DSBs nach der Bestrahlung beeinträchtigen. Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass eine Hemmung von Sirt1 mittels Sirtinol die unter glukosefreien Bedingungen in Tumorzellen auftretende Beeinträchtigung der Reparatur strahleninduzierter DNA-DSBs teilweise aufheben kann. Der hemmende Effekt eines Glukoseentzugs auf die DNA-DSB-Reparatur konnte in Tumorzellen jedoch nicht nur unter glukosefreien Bedingungen beobachtet werden. So genügte eine Reduktion der Glukosekonzentration auf 0,5 g/l, um die DSB-Reparatur nach der Bestrahlung in gleichem Maße zu beeinträchtigen wie durch einen kompletten Entzug der Glukose. Des Weiteren stellte sich heraus, dass die Reparatur von DNA-DSBs in Tumorzellen unter glukosefreien Bedingungen bereits nach einer Bestrahlung mit 2 Gy durch die Autophagie begünstigt wird. Schließlich wurde gezeigt, dass neben der DNA-DSB-Reparatur auch der Stoffwechsel der Tumorzellen durch den Glukoseentzug beeinflusst wird. So beeinträchtigte der Entzug von Glukose die strahleninduzierte Umstellung des Glukosestoffwechsels, die mit einer Verstärkung der aeroben Glykolyse und einer Abnahme der mitochondrialen Glukoseoxidation einherging, was ebenfalls zur Radiosensitivierung der Zellen beitragen kann. Im Gegensatz zu den Tumorzellen führte der Glukoseentzug bei den normalen Fibroblasten weder zu einer Radiosensitivierung noch zu einer Beeinträchtigung der Reparatur strahleninduzierter DNA-DSBs. Zudem hatte der Glukoseentzug hier keinen Einfluss auf die Histonacetylierung sowie KAP1-Phosphorylierung nach der Bestrahlung. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Glukoseentzug in vitro eine geeignete Strategie darstellt, um selektiv Tumorzellen gegenüber einer Strahlenbehandlung zu sensitivieren, ohne die Strahlenempfindlichkeit normaler Zellen zu beeinflussen.gerGlucose starvationRadiotherapyDNA repairChromatinRadiosensitizationGlukoseentzugRadiosensitivierung540GlucoseStrahlentherapieDNS-ReparaturChromatinDoctoralThesis510484859urn:nbn:de:bsz:100-opus-15109