publ-mit-podpubl-mit-podHausmann, RudolfNoll, Philipp2024-04-082024-04-082022-08-022022https://hohpublica.uni-hohenheim.de/handle/123456789/6742The highest titer reported for heterologous Rhamnolipid (RL) production is 14.9 g/L. However, biomass generation, as a large carbon sink, was a significant drawback in this process with roughly 50 more biomass than product produced. This problem is addressed in this thesis leveraging temperature as control variable and a molecular temperature sensor, an RNA thermometer (RNAT). RNAT generally refers to secondary loop structures, in the 5’ untranslated region of the mRNA, that form at certain temperatures and therefore regulate translation in dependence of temperature. The ROSE (repression of heat shock gene expression) RNAT evaluated in the first original research article in the heterologous system P. putida KT2440 pSynpro8oT_rhlAB originates from P. aeruginosa. The ROSE element regulates, in dependence of ambient temperature, the translation of rhlA and via a polar effect also the translation of rhlB therefore indirectly RL synthesis. It was found that in the ROSE RNAT-controlled system, the RL production rate was 60% higher at cultivations of 37°C than at 30°C. However, besides the regulatory effect of the RNAT, as revealed by control experiments, multiple unspecific metabolic effects may be equally responsible for the increase in production rate. After screening for even more efficient regulatory structures, a fourU RNAT was identified. Natively, this fourU RNAT regulates the expression of the heat shock gene agsA of Salmonella enterica and its regulatory capability can easily be modified by site-directed mutagenesis. The experimental data collected in the second original research article confirms the functionality of the fourU RNAT in the heterologous RL production system. The data suggested improved regulatory capabilities of the fourU RNAT compared to the ROSE element and a major effect of temperature on RL production rates and yields. The average RL production rate increased by a factor of 11 between 25°C and 38°C. Control experiments confirmed that a major part of this increase originates from the regulatory effect of the fourU RNAT rather than from an unspecific metabolic effect. With this system YP/X values well above 1 (about 1.4 gRL/gBM) could be achieved mitigating the problem of high biomass formation compared to product synthesis. Also, YP/S values of about 0.2 gRL/gGlc at elevated temperatures of 37-38°C were reached in shake flasks. The system was subsequently tested in a proof-of-concept bioreactor process involving a temperature switch. With this simple batch experiment and a temperature switch from 25°C to 38°C not only a partial decoupling of biomass formation from product synthesis was achieved but also an around 25% higher average specific rhamnolipid production rate reached compared to the so far best performing heterologous RL production process reported in literature (average specific production rate: 24 mg/(g h) vs. 32 mg/(g h)). However, to achieve higher titers while reducing side product formation a suitable feeding strategy and more complex temperature profiles may be required. Temperature variations in turn cause several metabolic changes, many of which are complex and interdependent. Models that describe biological processes as a function of temperature are thus essential for improved process understanding. The goal of the peer reviewed review article “Modeling and Exploiting Microbial Temperature Response”, shown in this thesis, was to present an overview of various temperature models, aid comprehension of model intent and to facilitate selection and application. Since not all metabolic interdependencies and mechanisms during temperature variation are known for the reasonable connection of input-output relationships, a suitable modeling approach seemed to be neural networks. Neural networks as black box models do not require mechanistic a priori knowledge but representative historic datasets. To collect training data, different temperature profiles or constant temperatures for a bioreactor process with P. putida KT2440 pSynpro8oT_rhlAB were applied and concentration curves for biomass, glucose and RL recorded. Subsequently, the data was fed into the neural network to compute RL titer as output. An exponential temperature profile yielded at the highest RL value of approx. 9 g (around 13 g/L) less biomass (around 12 g/L) than product. These values were reached after only 30 h consuming just 45 g of glucose. Hence, at this timepoint 36 weight-% of the consumed glucose could be assigned to mono-RL (YP/S = 0.19 gRL/gGlc) and biomass (YX/S = 0.17 gBM/gGlc. The so far best performing heterologous RL production process, yielded 23.2 g (14.9 g/L) mono-RL from >250 g of consumed glucose (YP/S = 0.10 gRL/gGlc) in >70 h using the same strain and medium but a constant temperature of 30°C.Der höchste für die heterologe Produktion von Rhamnolipiden (RL) beschriebene Titer beträgt 14,9 g/L. In diesem Prozess war die hohe Bildung von Biomasse ein erheblicher Nachteil, da etwa 50% mehr Biomasse als Produkt produziert wurde. Dieses Problem wird in dieser Arbeit durch den Einsatz der Temperatur und eines molekularen Temperatursensors, eines RNA-Thermometers (RNAT), adressiert. RNAT sind sekundäre Schleifenstrukturen in der 5-untranslatierten Region der mRNA, die sich bei bestimmten Temperaturen bilden und daher die Translation in Abhängigkeit dieser regulieren. Das im ersten Forschungsartikel evaluierte ROSE (repression of heat shock gene expression) RNAT im heterologen System P. putida KT2440 pSynpro8oT_rhlAB stammt aus P. aeruginosa. Das ROSE-Element reguliert in Abhängigkeit von der Temperatur die Translation von rhlA sowie über einen polaren Effekt die Translation von rhlB und so indirekt die RL-Synthese. Es wurde festgestellt, dass im ROSE-RNAT-gesteuerten System die RL-Produktionsrate bei Kultivierungen von 37°C um 60% höher war als bei 30°C. Neben dem regulatorischen Effekt des RNAT, wie sich in Kontrollexperimenten zeigte, dürften jedoch auch mehrere unspezifische metabolische Effekte für die Erhöhung der Produktionsrate verantwortlich sein. Nach einem Screening nach effizienteren regulatorischen Strukturen wurde ein fourU RNAT identifiziert. Dieses fourU RNAT reguliert nativ die Expression des Hitzeschockgens agsA von Salmonella enterica, und seine Regulationsfähigkeit kann durch ortsgerichtete Mutagenese leicht verändert werden. Die experimentellen Daten, die im zweiten Forschungsartikel gesammelt wurden, bestätigen die Funktionalität des fourU RNAT in einem heterologen RL-Produktionssystem. Die Daten deuten auf verbesserte regulatorische Fähigkeiten des fourU RNAT im Vergleich zum ROSE-Element hin sowie auf einen wesentlichen Einfluss der Temperatur auf die RL-Produktionsraten und -erträge. Die durchschnittliche RL-Produktionsrate stieg zwischen 25°C und 38°C um das 11-fache. Kontrollexperimente bestätigten, dass ein Großteil dieses Anstiegs auf die regulatorische Wirkung des fourU RNAT und nicht auf einen unspezifischen metabolischen Effekt zurückzuführen ist. Mit diesem System konnten YP/X-Werte von weit über 1 (etwa 1,4 gRL/gBM) erreicht werden, wodurch das Problem der hohen Biomassebildung im Vergleich zur Produktsynthese entschärft wurde. Außerdem wurden in Schüttelkolben YP/S-Werte von etwa 0,2 gRL/gGlc bei erhöhten Temperaturen von 37-38°C erreicht. Das System wurde anschließend in einem Proof-of-Concept-Bioreaktorprozess mit einem Temperaturschalter getestet. Mit diesem einfachen Batch-Experiment und einem Temperaturwechsel von 25°C auf 38°C wurde nicht nur eine teilweise Entkopplung der Biomassebildung von der Produktsynthese erreicht, sondern auch eine rund 25 % höhere durchschnittliche spezifische Rhamnolipid-Produktionsrate im Vergleich zu dem bisher besten in der Literatur beschriebenen heterologen RL-Produktionsprozess (durchschnittliche spezifische Produktionsrate: 24 mg/(g h) vs. 32 mg/(g h)). Um höhere Titer zu erreichen und gleichzeitig die Bildung von Nebenprodukten zu verringern, sind jedoch eine geeignete Fütterungsstrategie und komplexere Temperaturprofile erforderlich. Temperaturschwankungen bewirken wiederum komplexe und voneinander abhängige metabolische Veränderungen. Modelle, die biologische Prozesse in Abhängigkeit von der Temperatur beschreiben, sind daher für ein besseres Prozessverständnis unerlässlich. Ziel des in dieser Arbeit gezeigten Übersichtsartikels "Modeling and Exploiting Microbial Temperature Response" war es, einen Überblick über verschiedene Temperaturmodelle zu geben, das Verständnis für die Intention der Modelle zu vermitteln und so die Auswahl und Anwendung zu erleichtern. Da für die sinnvolle Verknüpfung von Input-Output-Beziehungen nicht alle metabolischen Abhängigkeiten bei Temperaturvariationen bekannt sind, schien ein geeigneter Modellierungsansatz neuronale Netze zu sein. Zur Sammlung von Trainingsdaten wurden verschiedene Temperaturprofile für einen Bioreaktorprozess mit P. putida KT2440 pSynpro8oT_rhlAB verwendet und Konzentrationskurven für Biomasse, Glucose und RL aufgenommen. Anschließend wurden die Daten in das neuronale Netz eingespeist, um den RL-Titer als Ausgabe zu berechnen. Ein exponentielles Temperaturprofil ergab beim höchsten RL-Wert von ca. 9 g (ca. 13 g/L) weniger Biomasse (ca. 12 g/L) als Produkt. Diese Werte wurden bereits nach 30 Stunden erreicht, wobei nur 45 g Glukose verbraucht wurden. Somit konnten zu diesem Zeitpunkt 36 Gew.-% der verbrauchten Glukose zu Mono-RL (YP/S = 0,19 gRL/gGlc) und Biomasse (YX/S = 0,17 gBM/gGlc) zugeordnet werden. Der bisher beste heterologe RL-Produktionsprozess lieferte 23,2 g (14,9 g/L) Mono-RL aus >250 g verbrauchter Glukose (YP/S = 0,10 gRL/gGlc) in >70 h unter Verwendung desselben Stammes und Mediums bei einer konstanten Temperatur von 30°C.enghttp://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_mit_pod.phpMolecular bioprocess controlRNA ThermometerHeterologous rhamnolipid biosynthesisPseudomonas putidaBiosurfactantMolekulare BioprozesskontrolleRNA ThermometerHeterologe Rhamnolipid-BiosynthesePseudomonas putidaBiotensid570PseudomonasBiotensidThermoregulationKultivierungDoctoralThesis1812805268urn:nbn:de:bsz:100-opus-20502