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Entwicklung und Charakterisierung verschiedener humaner 3D Fettgewebemodelle mit und ohne Hydrogelmatrix als in vivo nahe Alternative
(2023) Albrecht, Franziska Brigitte; Kluger, Petra
Humanes Fettgewebe sekretiert hunderte regulatorisch aktive Hormone, die bei der Entstehung und Manifestierung schwerwiegender Krankheiten wie Diabetes oder kardiovaskulären Erkrankungen beteiligt sind. Um die Vorhersagekraft von in vitro Modellen zu verbessern und die Komplexität des nativen Fettgewebes besser nachzubilden, werden dringend dreidimensionale (3D) in vivo nahe Fettgewebemodelle benötigt. Um solch ein flexibel anwendbares möglichst physiologisches Modell aufzubauen wurde in dieser Arbeit der Aufbau und die Evaluierung verschiedener 3D Fettgewebemodelle teils mit artifizieller Matrix angestrebt und im Anschluss mit dem nativen Zustand vergleichen. Beginnend wurden aus primärem humanem Fett Lobuli in verschiedenen Größenbereichen isoliert, kultiviert und der Zelltod sowie Zeichen der Lipolyse bestimmt. Es hat sich gezeigt, dass Lobuli mit einem Gewicht von 27 – 70 mg über 15 Tagen die stabilsten Ergebnisse geliefert haben und wurden somit tiefergehend analysiert. Bei der Analyse der Viabilität und Zellfunktionalität in Form der Lipidakkumulation und der Expression von Perilipin A konnte bewiesen werden, dass Lobuli als Fettgewebemodell genutzt werden können. Als weiteres Modell erfolgte die Etablierung von Sphäroiden aus humanen primären Stammzellen aus dem Fettgewebe (adipose-derived stem cells, ASC). Die Sphäroide wurden für 14 Tage adipogen differenziert und währenddessen die Veränderung des Volumens und der Rundheit sowie die Expression von Zelltodmarkern und das adipogene Differenzierungspotenzial betrachtet. Dabei haben Sphäroide mit mehr als 100.000 Zellen ihr Volumen über die Zeit verkleinert und Apoptose- und Nekrosemarker an den Tagen 0 und 14 gezeigt. Sphäroide bis 100.000 Zellen haben ihr Volumen während der Differenzierung leicht vergrößert und haben die meisten Lipide akkumuliert, Perilipin A und Kollagen Ⅵ exprimiert. Somit konnten ASC-basierte Sphäroide aus 10.000 Zellen, mit signifikanter Lipidzunahme, als weiteres Fettgewebemodell mit hohem Potenzial identifiziert werden. Im Anschluss erfolgte die Etablierung von methacrylierter Gelatine (GelMA) als Biomaterial für die Verkapselung von primären ASCs und reifen Adipozyten (adipocyte, AC) mit anschließendem extrusions-basierten 3D Druck. Es konnte gezeigt werden, dass die homogene Verteilung der lipidgefüllten ACs in eine wässrige Biotintenlösung nur durch schnelles Herunterkühlen auf Eis möglich war. Der anschließende 3D Druck hatte, weder auf die Viabilität noch Funktionalität bzw. adipogene Differenzierung der Zellen signifikante Einflüsse. Die additiv aufgebauten Modelle wiesen an Tag 1 und 8 bzw. 15 in der Lebend-Tot-Färbung keinen vermehrten Zelltod im Vergleich zu den manuellen Modellen auf. Die Färbung der intrazellulären Lipide und Perilipin A sowie die Glycerolfreisetzung als Funktionalitätsmarker, haben dies bestätigt. Im Vergleich zu nativem Gewebe haben differenzierte ASCs (diffASC) nach der Differenzierung signifikant weniger lipidpositive Zellen und freigesetztes Glycerol gezeigt. Auch morphologisch betrachtet, haben ACs in GelMA mehr Ähnlichkeiten zum nativen Gewebe als diffASCs. Aufgrund der begrenzten Langzeitstabilität von GelMA, des Ursprungs und der Vernetzung wurden Biomaterialien ohne tierischen Ursprung evaluiert. Dabei hat sich das niedrig acetylierte Polysaccharid Gellan Gum (GG) als vielversprechendes Material erwiesen. Es konnten stabile und transparente Hydrogele durch die Vernetzung mit divalenten Ionen im Zellkulturmedium aufgebaut werden. Die 1 %-igen Hydrogele waren weder bei indirekter noch direkter Testung zytotoxisch oder haben Monozyten aktiviert. Bestätigt wurde es durch die Laktatdehydrogenase (LDH)-Freisetzung, den Resazurinumsatz und eine Lebend-Tot-Färbung. Azelluläre Gele wurden über 98 Tagen ohne signifikante Veränderungen erhalten und zeigten für Fettgewebe geeignete Materialeigenschaften. Aufgrund dieser Langzeitstabilität konnten diffASCs für 98 Tage in GG kultiviert werden und zu univakuolären Fettzellen reifen. Dies wurde durch die Färbung von intrazellulären Lipiden und Perilipin A sowie der Leptinsekretion und Glycerolfreisetzung bewiesen. Verglichen mit nativem Gewebe wiesen die diffASCs eine vergleichbare, wenn auch kleinere Morphologie, ähnliche Anteile an lipidpositiven und univakuolären Zellen auf. Auf Basis von GG konnten ACs erfolgreich verkapselt und aufgebaut werden. Hierbei erwies sich eine GG Konzentration von 0,5 % als geeignet, da homogen gemischte Hydrogele mit hohem Resazurinumsatz und geringer Glycerolfreisetzung kultiviert werden konnten. Für den additive Aufbau der GG-basierten Modelle, fand eine Optimierung zur Biotinte statt, was durch die initiale Zugabe divalenter Ionen zur Erhöhung der Viskosität und damit Druckbarkeit ermöglicht wurde. Die additiv gefertigten Modelle zeigten keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf Viabilität oder Funktionalität. Nach 32 Tagen in Kultur konnten univakuoläre und funktionale Zellen gezeigt werden. Durch die Erhöhung der GG Konzentration auf 1,5 % wurde ein erfolgreiches 6D Bioprintingverfahren etabliert. Auch hier zeigten die in GG verkapselten ASCs keine Viabilitäts-, Morphologie-, oder Differenzierungsunterschiede nach dem Druckprozess. Abschließend erfolgte ein Vergleich der etablierten Modelle wobei die Adipogenese der ASC-basierten Modelle und zum anderen der adipozytenspezifische Phänotyp evaluiert wurde. Hinsichtlich der Viabilität konnten keine Unterschiede festgestellt werden. Das adipogene Differenzierungspotenzial zeigte sich am stärksten im diffASC Hydrogel. Sowohl hier als auch in den Sphäroiden konnten eingelagerte Lipide ohne hormonelle Induktion mit Medium nachgewiesen werden. Die Betrachtung der adipozytenspezifischen Morphologie der ausgereiften Modelle erlaubte den Rückschluss, dass die Zellen in den Monolayern den unausgereiftesten Zustand in Form von multivakuolären, elongierten diffASCs mit Aktin-Stressfasern aufweisen. Die Zellen der anderen Modelle zeigen deutlich größere Lipidvakuolen mit einem abgerundeten Zytoskelett. Die quantitative Bestimmung der Lipid-, Leptin- und Glycerolmenge legt nahe, dass sich die Zellen, außer die im Monolayer, in einem Steady-State befinden, was die relative Genexpression adipozytenspezifischer Gene untermauert. Zusammengefasst wurden in dieser Arbeit sechs unterschiedliche Fettgewebemodelle entwickelt und mit nativem Gewebe verglichen. Jedes Modell weist individuelle Stärken auf, wodurch sich der Anwendungsbereich und die Forschungsfragen unterscheiden. Um ein möglichst in vivo-nahes Modell zu erreichen, sind diffASCs in GG Hydrogelen ein vielversprechendes, langzeitstabiles, ausgereiftes Fettgewebemodell und können daher als flexible Plattform für in vitro Testungen genutzt werden.