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Analyse viraler Promotoren von Phycodnaviren und deren Interaktion mit Transkriptionsfaktoren
(2025) Wahl, Benjamin; Pfitzner, Artur
Acanthocystis turfacea Chlorella Virus 1 (ATCV-1) ist ein dsDNA-Virus aus der Gattung Chloroviren, welches Chlorella heliozoae infiziert. Das Virus besitzt 860 offene Leserahmen (open reading frames, ORF), die für die Gene codieren, die für einen korrekten Virusreplikationszyklus benötigt werden. Diese Gene werden in sehr frühe/frühe/späte Gene eingeteilt. Diese Einteilung basiert auf den Zeitpunkten der Expression der Gene. Für die Expression dieser Gene nutzt ATCV-1 virale Promotoren, die eine Mischung aus eukaryotischen und prokaryotischen Bestandteilen darstellen. Die erfolgreiche Initialisierung des Replikationszyklus mit Hilfe von sehr frühen und frühen Genen ist essenziell für eine vollständige Virusreplikation. In früheren Arbeiten konnten Gene in Paramecium busaria Chlorella Virus 1 (PBCV-1) identifiziert werden, die als sehr frühe Gene klassifiziert wurden. Das Ziel dieser Arbeit beinhaltet die Untersuchung sehr früher/ früher Gene und deren Promotoren. Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Interaktion von Proteinen, deren Promotor ein Hex-Motiv (XXXCGTGG) enthalten, mit verschiedenen Faktoren untersucht werden. Basierend auf Sequenzvergleich-Analysen zwischen den sehr frühen Genen aus PBCV-1 und den Genen aus ATCV-1 wurden 20 Gene identifiziert. Die Promotoren dieser Gene wurden auf ihre Motive analysiert. Mit Hilfe einer RT-qPCR konnte gezeigt werden, dass diese Gene in der sehr frühen Phase der Virusreplikation (5 min p.i.) alle aktiv waren. Die Analyse in Pflanzen konnte zeigen, dass das Hex-Motiv in Verbindung mit mindestens einer TATA-Box ideal für die Expression der frühen Promotoren ist. Weitere Analysen konnten zeigen, dass für eine generelle Expression in Pflanzen mindestens zwei TATA-Box-Motiv in Verbindung mit anderen Motiven existieren müssen. In HEK293-Zellen konnte für die Promotoren mit dem Hex-Motiv ebenfalls eine Aktivität demonstriert werden. In der Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Arg7-ASL-System zur Untersuchung der Aktivität von viralen Promotoren genutzt werden konnte. Alle frühen Promotoren zeigten eine Aktivität in Chlamydomonas reinhardtii, inklusive Promotoren anderer Viren. Promotoren mit dem Hex-Motiv zeigten, im Vergleich zu Promotoren ohne dieses Motiv, eine Interaktion mit einer Vielzahl von unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren, die zu den bZIP-Transkriptionsfaktoren gezählt werden. Mit Hilfe zweier Proteine, Z174L und Z765R, deren Promotoren das Hex-Motiv besitzen, konnten mehrere mögliche Interaktionspartner mit Hilfe von „proximity based labeling“, darunter Proteine wie z.B. Actin, Thioredoxin und ein Histon-Acetlytransferase-Protein, identifiziert werden. Diese Proteine können mit der Transkription in Verbindung gebracht werden, was die vermutete Funktion von Z765R als Transkriptionsfaktor stützt. Z174L ist vermutlich ein Transkriptionsfaktor bzw. eine Endonuklease. Auch hierfür konnten Proteine, die diese Hypothese unterstützen, mit Hilfe der Massenspektrometrie identifiziert werden. In dem dritten Teil der Arbeit konnte mit Hilfe von Yeast-1-Hybrid-Analysen und dem Promotor von Z063L ein neues Protein, Activating protein 63 (Ap63), in Chlamydomonas reinhardtii identifiziert werden. Dieses Protein besitzt Motive, die mit DNA-Bindung in Verbindung gebracht werden. Kombiniert mit Analysen der Sequenz, handelt es sich bei dem hier entdeckten Protein vermutlich um einen Transkriptionsfaktor. Das Gesamtbild dieser Studie zeigt auf, wie abhängig das Virus von seinem Wirt für eine erfolgreiche Replikation ist und wie breit das Spektrum der Virus-Wirt-Interaktion ist. Die sehr frühe Genexpression (5 min p.i.) spielt eine essenzielle Rolle für die Replikation. Hierfür macht sich das Virus Proteine (vor allem Transkriptionsfaktoren) des Wirts zunutze, um die gesamte Genexpression der Wirtszelle auf die Virusreplikation umzuprogrammieren.
Wirt-Virus Wechselwirkungen bei der Infektion durch Acanthocystis turfacea Chlorella Virus 1
Regulation der Genexpression früher Gene und des Ubiquitin-Systems
(2021) Lindner, Kamila; Pfitzner, Artur J. P.
Acanthocystis turfacea Chlorella Virus 1 (ATCV-1) is a virus of the genus Chloroviruses that infects the unicellular green alga Chlorella heliozoae. The infection with ATCV-1 is lethal for the algae and requires the correct expression of the 860 hypothetical virus genes. These genes are divided into early, early/late and late genes which are expressed at different times, depending on their protein function. Gene expression is regulated by their corresponding viral promoters and can be controlled by viral or host-specific transcription factors. The stability of proteins is regulated by the host’s ubiquitin system. This study investigated the expression of early viral genes and the ubiquitin- mediated protein degradation regulated by ATCV-1. By investigating the promoters of the early genes of ATCV-1 Z174L, Z765R and Z798L respectively, consensus sequences were identified including a Hex motif and a TATA box that can be bound by viral, but most importanly, host transcription factors. By in vivo interactions with G-box binding factors, a direct regulation of the early promoters, including aforementioned Hex motif, could be demonstrated. Along with this new regulatory mechanism for the expression of early viral genes, evidence for additional mechanisms for the regulation of early genes with different consensus sequences, such as AATGACA, were found. In the second part of this study, three novel viral proteins were identified as proteins of the ubiquitin system: a viral ubiquitin (Z203L), a viral RING E3 ligase (Z292L) and a viral SKP1 protein (Z339L). Experiments have shown that ATCV-1 is able to interfere with the host’s ubiquitin system using these proteins. Although the E3 ligases are responsible for the specific ubiquitination of the target proteins (e.g. Z292L in the case of enolase), the additional expression of a viral ubiquitin ensures a sufficient amount of the signal protein is present. The results of this study demonstrate a wide range of host-virus interactions at the level of gene regulation and protein degradation. ATCV-1 can use host factors to initiate its own gene expression and, with the help of the components of the ubiquitin system encoded in the viral genome, reprogram the host’s protein degradation.