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Antimikrobielle Aktivität der Histone bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen
(2017) Kunkel, Yasmin; Stange, Eduard F.
The human intestine harbours a multitude of microorganisms. In addition to its func-tion as a protective layer against pathogens, it has to prevent an excessive immune answer against commensales simultaneously. Antimicrobial Peptides (AMPs) with their cationic character are playing an essential role in protection, because they are able to form voltage dependent channels on the surface of microorganism, which kill pathogens. In addition to the classical AMPs more antimicrobial active polypeptides, such as members of the histone family, were isolated. Histones are alkaline proteins, which are components of the chromatine. They are foremost responsible for packaging the DNA and for posttranslational modifications. Five different families can be differentiated: the core histones H2A, H2B, H3 and H4, as well as the linker histone H1. While extracellular histones show strong antimicrobial activity against a broad spectrum of microorganisms, the mechanism of their toxicity has not yet been sufficiently determined. If the antimicrobial protection layer of the intestine is weakened, due to a diminished expression of AMPs for instance, microorganisms can penetrate the mucosa and trigger inflammations. These findings have been confirmed in different tissues of patients with inflammatory bowel diseases (IBD), such as Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC). The aim of this work is to determine whether histones play a role in IBD. In the first part a systematic analysis of the transcriptome (Q-PCR) and the transla-tome (Western Blotting) of the core histones of colonic tissue was performed. In tis-sues of patients with CD gene expression data showed generally an increase of his-tones. In the cases of H2A and H2B the increase was significant. The quantification on the protein level offered an extreme variance of the expression of all core histones, irrespective of the analysed group. Significant differences were not detected. However, in trend H2B was lower in inflammation. After the systematic analysis, histones were then isolated of human colonic tissue. Before the extracted histones were fractionated via RP-HPLC and screened via MALDI-TOF-MS, different methods for the isolation of histones had been compared. The antimicrobial activity of the isolated histones of different intestinal tissues and mucus showed no differences between healthy controls and patients with IBD in flow cytometric tests. A significant increase of the histone activity in inflamed tissues of UC was only detected against S. aureus. The impact of the extracted histones seems to be strain-specific and higher against gram-positive species. As expected, extracel-lular histones could be detected in the mucus by immunehistological staining. Through ELISAs, protein concentrations of H2A and H2B were determined in the mucus and thus a slight increase of the histone proteins in UC was observed. In the last part of this work, the interactions of recombinant histones among them-selves and with other AMPs were analysed by flow cytometric viability assays. A strain-specific increase of the antimicrobial activity of histones among themselves and with AMPs was found. Thereby synergistic effects occurred frequently. The in-teractions of histones against several bacteria were visualised by electron microscope images and furthermore an agglutination of the microorganisms as well as a massive loss of cell integrity were detected. Variantions of the histones’ transcriptome and the translatome, as well as variations of the antimicrobial activity of histones in CED would have been evaluated as patho-logic defects. However, in this work such effects could not been confirmed. Because of their enormous antimicrobial activity histones still play an important role in the protection against microorganisms in the colon. Further studies have to show, if his-tones possess a therapeutic potential, and if they can be used as new antibiotics. This work was able to verify the strong potential of histones against different pathogens, which is absolutely comparable with the potential of classic AMPs, and could pro-mote inspiration for subsequent studies.
Mechanismen der diätinduzierten Störungen auf die Darmbarrierefunktion
(2024) Filipe Rosa, Louisa; Bischoff, Stephan C.
Störungen der Darmbarriere sind bei der Entstehung intestinaler und metabolischer Erkrankungen involviert. Dabei beeinflussen sowohl intrinsische als auch extrinsische Faktoren die Funktionalität der Darmbarriere. Obwohl dieser Zusammenhang generell akzeptiert ist, sind die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen nicht hinreichend aufgeklärt. Darüber hinaus gibt es kaum Konzepte, wie eine dysfunktionale Darmbarriere diagnostisch genutzt oder therapeutisch behandelt werden könnte. Im Rahmen des vorliegenden Promotionsprojektes wurden deshalb die molekularen Effekte extrinsischer Nahrungsfaktoren sowie intrinsischer neuronaler und immunologischer Faktoren auf die Darmbarriere untersucht. Darüber hinaus wurde ein therapeutischer Ansatz bei diätinduzierter Darmbarrierestörung evaluiert sowie die Bedeutung der Darmbarrierefunktion für die Diagnostik von Nahrungsmittelunverträglichkeiten (NMUs) geprüft. Sowohl Mangelernährung als auch Überernährung wirken sich negativ auf die Darmbarriere aus. In Vorarbeiten wurden Darmbarrierestörungen im Tiermodell für Adipositas untersucht und gezeigt, dass Präbiotika und kurzkettige Fettsäuren präventiv wirksam sind. Im Rahmen des ersten Promotionsprojektes wurden die Auswirkungen eines Vitamin A (VA)- und Vitamin D (VD)-Mangels auf die Darmbarrierefunktion untersucht. Dazu wurden 36 C57BL/6J Mäuse für 12 Wochen entweder mit einer Kontrolldiät, einer Vitamin A-defizienten oder einer Vitamin D-defizienten Diät gefüttert und die Rolle verschiedener Signalwege in einem Organoid- Zellmodell evaluiert. Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl ein VA- als auch ein VD-Mangel die immunologische Darmbarriere, insbesondere die antimikrobielle Peptidabwehr, im Ileum und Colon beeinträchtigten. Diese Veränderungen gingen mit Störungen des Wnt-Signalweges und vermehrten inflammatorischen Prozessen im Colon einher. Zudem regulierten VA und VD die Expression antimikrobieller Peptide durch den Jak/STAT5-Signalweg. Die Ergebnisse zeigen, dass VA und VD die Darmbarrierefunktion beeinflussen und dass bei Mangelernährung der Vitaminstatus überprüft und gegebenenfalls korrigiert werden sollte. Im zweiten Promotionsprojekt wurde die Darmbarrierefunktion in einem Tiermodell für Adipositas untersucht. Insbesondere wurde die Rolle des intestinalen serotonergen Systems nach Barrierestörung durch eine Western-Style Diät (WSD) sowie die Darm-Leber-Achse analysiert. Dazu wurden 32 Mäuse, welche einen knock-out im Gen für den Serotonin- Wiederaufnahme-Transporter (SERT) aufweisen (SERT-/-) sowie 32 Wildtyp Mäuse (SERT+/+) für 12 Wochen entweder mit einer Kontrolldiät oder einer WSD mit oder ohne 30 %-iger Fruktoselösung (F) gefüttert. Die Ergebnisse zeigen, dass Veränderungen des intestinalen serotonergen Systems die Gen- und Proteinexpression von Tight Junctions (TJ) reduzierten, was mit einer erhöhten Dünndarmpermeabilität einherging. SERT-/- Mäuse wiesen eine Abnahme der Mukusproduktion sowie der antimikrobiellen Peptidabwehr auf. Dadurch kam es zu einer vermehrten bakteriellen Translokation und einer Zunahme von Leberentzündung und -steatose. Somit spielt das serotonerge System bei der Entwicklung von Darmbarrierestörungen, bakterieller Translokation sowie metabolischen Erkrankungen eine Rolle. Im dritten Promotionsprojekt wurden neue Therapieansätze zur Behandlung von Darmbarrierestörungen untersucht. Konkret wurde geprüft, ob antimikrobielle Peptide diätinduzierte Störungen der Darmbarriere sowie metabolische Folgeerkrankungen reduzieren. Dazu erhielten 84 C57BL/6J Mäuse für 18 Wochen entweder eine Kontrolldiät oder eine WSD±F. Ab der 13. Versuchswoche wurden die Mäuse zusätzlich entweder mit HD51-9, hBD2 oder einem Kontrollpeptid behandelt. Zudem wurden potenzielle Signalwege anhand des Organoid-Zellmodells evaluiert. Die Ergebnisse zeigen, dass eine 6-wöchige Defensinbehandlung mit HD51-9 oder hBD2 den Grad der Lebersteatose sowie die Glukosetoleranz bei WSDF-gefütterten Mäusen verbesserte, die Expression ilealer TJ-Proteine erhöhte und die Darmpermeabilität reduzierte. Des Weiteren resultierte die therapeutische Intervention in einer Zunahme der intestinalen antimikrobiellen Peptidabwehr, wobei der Wnt-, TLR/Myd88-, p38 MAPK sowie der Jak/STAT-Signalweg in diese Defensinvermittelten Effekte involviert waren. Defensin-Peptide sind somit ein neuer, vielversprechender Therapieansatz für die Behandlung einer dysfunktionalen Darmbarriere. Im vierten Promotionsprojekt wurde untersucht, ob die Darmbarriere, das enterische Nervensystem (ENS) sowie das mukosale Immunsystem bei der Pathologie von Nicht- Zöliakie-Weizensensitivität (NCWS) involviert sind. Dazu wurden 142 Patienten rekrutiert und anhand einer Allergiediagnostik als betroffen (n = 94) oder nicht betroffen (n = 48) klassifiziert. Zudem wurden mittels einer oralen, doppelblinden, placebokontrollierten Weizenprovokation (DBPCFC) 15 Patienten mit NCWS sowie 19 Kontrollen identifiziert. Anschließend wurden 78 Patienten im Rahmen einer konfokalen Laserendoskopie (CLE) duodenal mit Nahrungsmittelallergenen provoziert. Die Untersuchungen von Gewebeproben mittels RNA-Sequenzierung sowie histologischer und immunhistochemischer Färbungen zeigen, dass Patienten mit NCWS eine Veränderung der Mastzellzahl, eine vermehrte Aktivierung des ENS und möglicherweise Veränderungen des Defensinsystems der Darmbarriere aufwiesen. Im Rahmen der Promotionsprojekte konnten Mechanismen, die diätinduzierten Darmbarrierestörungen zugrunde liegen, beschrieben und ein neuer Therapieansatz aufgezeigt werden. Die Daten unterstreichen die Bedeutung der Darmbarriere für die Pathophysiologie, Diagnostik und Therapie ernährungsassoziierter Erkrankungen.