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TRPL-Recycling in Photorezeptoren von Drosophila : Identifikation beteiligter Gene mittels tsCRISPR Mutagenesescreen
(2025) Zeger, Matthias; Huber, Armin
Die präzise Regulation des intrazellulären Transports von Membranproteinen ist essenziell für die Funktion neuronaler Zellen. Störungen in diesem Prozess, insbesondere im Proteinrecycling über den Retromerkomplex, stehen im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer oder Parkinson. In dieser Arbeit wurde die lichtabhängige Translokation des TRPL (Transient Receptor Potential Like)-Ionenkanals im Drosophila-Komplexauge als Modell genutzt, um molekulare Komponenten des Membranproteintransports zu identifizieren. Bei Dunkelheit ist TRPL in den Rhabdomeren lokalisiert und transloziert nach Belichtung, aus dem Rhabdomer ins Zellinnere. Bei anhaltender Belichtung wandert der Großteil des TRPLs innerhalb von 12 Stunden zu einem Speicherkompartiment, das bislang als das Endoplasmatische Retikulum identifiziert wurde. Bei ausbleibendem Lichtreiz bzw. bei einer erneuten Dunkeladaptation der Photorezeptorzellen von Drosophila wandert TRPL innerhalb von 90–120 min wieder zurück in die rhabdomerische Membran. Ein augenspezifisches CRISPR-Knockout-System für Drosophila wurde etabliert, um gezielt Rab-GTPasen – zentrale Regulatoren des intrazellulären Vesikeltransports – im Zusammenhang mit dem TRPL-Recycling zu untersuchen. Durch die Analyse der TRPL-Lokalisation unter verschiedenen Lichtbedingungen konnten mehrere Rab- Proteine mit potenzieller Funktion im Recyclingprozess identifiziert und immunhistochemisch charakterisiert werden. Besonders starke Effekte auf das TRPLRecycling zeigten die Rab3-, Rab4-, Rab7-, Rab32-, Rab40- und RabX2-Knock-out Mutanten. Rab3, das unter anderem an späten Endosomen lokalisiert ist, wurde erstmals in vivo als Regulator für das Proteinrecycling identifiziert. RabX2 hingegen ist am trans-Golgi lokalisiert; sein Knock-out führte zu einer Akkumulation von TRPL im trans-Golgi während des retrograden Transports zurück in das Rhabdomer. Die Ergebnisse legen nahe, dass TRPL auch über einen zweiten ER-unabhängigen Weg zurück in das Rhabdomer recycelt wird, da ein Knock-Out von Rab3, Rab7, Rab32 oder Rab40 die ER/TRPL-Kolokalisation stark verringert aber der Rücktransport weniger stark beeinflusst wird. Außerdem wurde eine weitere TRPL-Recyclingroute über den trans-Golgi identifiziert welche abhängig von RabX2 ist. VII Im zweiten Teil der Arbeit wurde mittels TurboID-basiertem Biotin-Proximity Labeling nach TRPL-assoziierten Interaktionspartnern gesucht. Eine Auswahl der dabei identifizierten Kandidaten wurde funktionell analysiert, um ihren Einfluss auf die TRPLTranslokation zu bewerten. In dem Screen nach TRPL Interaktionspartnern wurden Signaltransduktionsproteine wie INAD, TRP und NorpA durch TRPL::TbID identifiziert. Darüber hinaus wurden Proteine wie Rab32 und Vps35 detektiert, die mit dem TRPLRecycling in Verbindung stehen, sowie weitere Proteine wie Sec61 und HIP-R, die potenziell mit ER-Stress assoziiert sind. Zu den weiteren identifizierten TRPLInteraktionspartnern gehörten Vap33, PIP82, Orp8, Sec63 und Sec22, die detailliert immunhistochemisch untersucht wurden. Dabei zeigte der Knock-out von Sec22 und Sec63 eine reduzierte Kolokalisation von TRPL mit Calnexin (Cnx), jedoch blieb der Rücktransport weitgehend wildtypisch – ein Phänotyp, der dem von Rab3-, Rab7-, Rab32- und Rab40-Knock-outs ähnelt. Die Orp8 Knock-out-Mutante zeigte nach erneuter Dunkeladaptation weiterhin eine TRPL/Cnx-Kolokalisation, was auf einen Defekt beim ER-Exit hinweist. Die PIP82-Nullmutante verursachte einen Internalisierungsdefekt sowie eine deutliche Abnahme des TRPL-Signals nach Lichtadaptation. Der Vap33 Knock-out führte bereits im Dunkelzustand zu anterograden Transportdefekt, da TRPL teilweise im Zytosol und ER lokalisiert war. Insgesamt konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass neben dem ERabhängigen Recyclingweg von TRPL auch ein ER-unabhängiger Transportmechanismus existiert. Beide Routen sind auf die Funktion verschiedener Rab-GTPasen angewiesen. Besonders hervorzuheben ist der Nachweis einer Beteiligung von Rab3 am Proteinrecycling in Drosophila-Photorezeptorzellen – ein bisher nicht beschriebenes Phänomen, das über die bekannte Rolle von Rab3 in der synaptischen Transmission hinausgeht. Darüber hinaus wurde erstmals ein TRPLRecyclingweg über den trans-Golgi-Apparat identifiziert, der auf die Aktivität von RabX2 angewiesen ist. Ergänzend dazu konnten mehrere potenzielle Interaktionspartner von TRPL durch Biotin-Proximity Labelling identifiziert werden, darunter Vap33, PIP82, Orp8, Sec63 und Sec22. Funktionelle Analysen deuten darauf hin, dass diese Proteine einen Einfluss auf die zelluläre Lokalisation und Translokation von TRPL haben und somit eine Rolle in seiner dynamischen Regulation spielen könnten.