Biochemical investigations on genetically modified oil crops

Abstract

The main purpose of this study was to develop a method of purification and characterization of Cry1Ab isolated from MON810 genetically modified maize. The second object was to study the effect of the genetic modification of MON810 and high-oleic sunflower on the oil composition. Therefore, the following investigations were performed: (1) Quantification of Cry1Ab toxin in different corn plant parts. (2) Development of a suitable method for purification of Cry1Ab from MON810. (3) Establishment of characterization method for Cry1Ab by mass spectrometry with regard to high peptide sequence coverage. (4) Evaluation of the effect of genetic modification on the oil composition compared with the conventional traits. The following results were obtained: Screening of Cry1Ab by ELISA is the most predominant technique for determination of Cry toxin content in plants. The determination of the toxin concentration resulted in highest levels for leaves (26.8 µg/g dry matter), while it was 1.5, and 1.0 µg/g for stalks and grains respectively. In our study, toxin content in leaves was about six times higher than in a previous study. There are no data available for the dry weight content of Bt toxins in stalk and grain, which could be compared to the obtained results. Although MON810 maize is one of the major genetically modified crops, informations on the character of the Cry1Ab purified from the MON810 maize is still limited, although such data are important for safety assessment studies. To my best knowledge, this study is the first investigation charactizing Cry1Ab toxin isolated from MON810 maize. The results of the present investigation indicated that the separation of the Cry1Ab protein from MON810 leaf extracts by HPLC techniques was not efficient. MALDI-TOF analyses showed that the major component separated with Cry1Ab was β-D glucosidase, which may be due to resembled isoelectric points. However, immuno-affinity purification using self-prepared affinity columns was very efficient to isolate pure Cry1Ab from MON810. The characterization of purified Cry1Ab was successfully done by SDS-PAGE, Western blot analysis and MS techniques. MALDI-TOF MS analyses were useful for component screening of Cry1Ab. Results showed that Cry1Ab is subjected to truncation by plant proteases into a core toxin with approximately 69 kDa. LC(ESI)-MS/MS gave a higher sequencing coverage of Cry1Ab (73 % of peptide sequence) compared to MALDI-TOF analysis (41% of peptide sequence). Further studies revealed that Cry1Ab had no detectable potential carbohydrates which might be covalently linked to the protein. The capillary electrophoresis technique was used for determination of the Cry1Ab purified from MON810 maize and proved to be a suitable method for determination of the Cry1Ab, but it was not successful for the detection of very low quantities (less than 0.03 mg/ml). Peptide mapping is one of the most powerful tools for protein identification and characterization. The use of HPTLC with the relatively new plates (ProteoChrom) was identified as a convenient tool for peptide mapping as compared to capillary electrophoresis, especially if put into consideration that HPTLC is less costly than capillary electrophoresis. The HPTLC method was able to resolve 13 peptides, while capillary electrophoresis resolved 19 peptides, obtained from the digested Cry1Ab toxin. Concerning lipid analyses, fatty acids and sterols were determined by gas chromatography, tocopherols by HPLC. For the determination of phospholipids, an HPTLC method was developed, resulting in lower detection limits than reported in previous studies. The present study proved that the genetic modification did not significantly affect the contents of fatty acids, sterols, tocopherols and phospholipids in transgenic maize oil. Apart from the increased amount of oleic acid in high-oleic sunflower oil, the genetic modification in sunflower did not produce unexpected effects on the oil composition. Therefore, with regard to the oil composition, both oils from genetically modified plants will be as safe as conventional oil types.

Das Hauptziel dieser Arbeit war es, ein Verfahren zur Aufreinigung und Charakterisierung des Toxins Cry1Ab in dem gentechnisch modifiziertem Mais MON810 zu entwickeln. Weiterhin war es das Ziel, die Auswirkungen der genetischen Veränderung von MON810 und high-oleic Sonnenblumen auf die Lipid-Zusammensetzung zu studieren. Daher wurden folgenden Untersuchungen durchgeführt: (1) Quantifizierung des Cry1Ab-Toxins in verschiedenen Teilen der Maispflanze. (2) Entwicklung einer geeigneten Methode zur Reinigung von Cry1Ab aus MON810. (3) Charakterisierung von Cry1Ab mit Hilfe der Massenspektrometrie. (4) Chemische Analyse der Öl-Zusammensetzung von MON810 Maisöl und high-oleic Sonnenblumenöl im Vergleich zu konventionellen Ölen. Folgende Resultate wurden erzielt: Die Bestimmung von Cry1Ab in MON810 Mais mittels ELISA ergab die höchsten Konzentrationen in Blättern (26,8 μg/g Trockenmasse), während die Gehalte im Stengel und im Korn deutlich niedriger ausfielen (1,5 bzw. 1,0 μg/g Trockenmasse). Die in den Blättern bestimmten Gehalte waren etwa sechsfach höher als in einer früheren Literaturstudies. Für Stengel und Korn gibt es keine Vergleichsdaten in der verfügbaren Literatur. Obwohl MON810 Mais eine der wichtigsten gentechnisch veränderten Nutzpflanzen ist, sind proteinchemische Informationen zu Cry1Ab begrenzt, eine wesentliche Voraussetzung für Sicherheitsbewertungen. Nach meinem besten Wissen liefert die vorliegende Arbeit die ersten Ergebnisse zur Charakterisierung des Cry1Ab-Toxins aus MON810 Mais. Die durchgeführten Untersuchungen zeigten, dass die Aufreinigung des Toxins aus Blattextrakten mittels HPLC nicht effizient war. MALDI-TOF-Analysen ergaben, dass die isolierte Hauptkomponente insbesondere mit dem Enzym β-D-Glucosidase verunreinigt war, wahrscheinlich auf ähnliche isoelektrische Punkte zurückzuführen. Dagegen erwies sich die Immuno-Affinitätsextraktion an selbst hergestellten Immuno-Affinitätssäulen als sehr effizient und erlaubte die Untersuchungen rein vorliegenden Cry1Ab mittels SDS-PAGE, Western-Blot-Analyse und MS-Techniken. Die Charakterisierung durch MALDI-TOF-Analysen zeigte, dass Cry1Ab durch pflanzliche Proteasen auf ein Kernprotein von etwa 69 kDa zugeschnitten wird. Mit Hilfe der LC(ESI)-MS/MS konnte eine höhere Abdeckung von Cry1Ab-Peptiden (73% der Peptid-Sequenz) im Vergleich zur MALDI-TOF-Analyse (41% der Peptid-Sequenz) erreicht werden. Weitere Studien zeigten, dass Cry1Ab keine potenziell nachweisbaren Kohlenhydrate aufwies, die kovalent an das Toxin gebunden sind. Die Capillarelektrophorese erwies sich als eine geeignete Methode zur Bestimmung von Cry1Ab, isoliert aus MON810, leider aber eignete sie sich nicht zur Bestimmung sehr geringer Mengen (weniger als 0,03 mg/ml). Peptid-Mapping ist eine der besten Methoden zur Protein-Identifizierung und Charakterisierung. Im Vergleich zur Capillarelektrophorese oder HPLC stellte die HPTLC auf speziellen ProteoChrom-Schichten eine preisgünstige und schnelle Alternative zum Peptid-Mapping dar. Mit der HPTLC-Methode konnten 13 Peptide aufgetrennt werden, während die Capillarelektrophorese Signale für 19 Peptide nach tryptischem Verdau von Cry1Ab lieferte. Im Rahmen der Lipidanalytik wurden die Fettsäure- und Sterinverteilung mittels Gaschromatographie, das Tocopherolmuster mittels HPLC untersucht. Zur Bestimmung der Phospholipide wurde eine HPTLC-Methode entwickelt, mit der geringere Nachweisgrenzen erreicht wurden als in den beschriebenen Methoden. Die erhaltenen Ergebnisse zu MON810 Maisöl zeigten keine Unterschiede zu konventionellem Maisöl. Abgesehen vom höheren Ölsäuregehalt konnten auch beim high-oleic Sonnenblumenöl keine Differenzen zu konventionellem Sonnenblumenöl aufgedeckt werden. Insofern kann es hinsichtlich der Lipidzusammensetzung keine Sicherheitsbedenken bei den beiden Ölen aus getechnisch modifizierten Pflanzen geben.