Quantitative Proteomanalyse von Pseudomonaden zur Aufklärung biotechnologisch relevanter Stoffwechselwege

Abstract

The main focus of this work was a quantitative proteome analysis of a variety of Pseudomonas strains with respect to the biotechnological synthesis of the base chemicals glyoxylic acid, butanol and vanillin. In addition, effects of the terpene citronellol on the proteome of P. aeruginosa were investigated. A second key aspect of this work involved the establishment of proteomics methods for the analysis of complex samples, especially for the analysis of membrane proteins. Using carbonate extraction followed by label-free MS-based quantification allowed the identification and quantification of a significant number of hydrophobic proteins which were not covered by the 2D-DIGE approach. In addition, the GeLCMSMS workflow was found to be a simple and efficient method for the analysis of total bacterial lysates. Using this method, about 30% of all proteins encoded by the P. putida KT2440 genome could be identified and quantified. In conclusion, this work demonstrated that different proteomics methods can substantially contribute to biotechnological strain development and the understanding of cellular networks.

Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der quantitativen Analyse des Proteoms verschiedener Pseudomonaden im Hinblick auf die biotechnologische Synthese der wirtschaftlich interessanten Basischemikalien Glyoxylsäure, Butanol und Vanillin. Des Weiteren wurde auch der Metabolismus des Terpens Citronellol in P. aeruginosa PAO1 untersucht. Neben den quantitativen Proteomanalysen im Rahmen der biotechnologischen Teilprojekte, beinhaltete diese Arbeit auch die Etablierung von geeigneten Analysemethoden. So konnten insbesondere für die Quantifizierung von Membranproteinen und des Gesamtproteoms geeignete Methoden der Probenvorbereitung und Quantifizierung etabliert werden. Mit Hilfe einer Carbonatextraktion und anschließender labelfreier massenspektrometrischer Quantifizierung konnte eine Vielzahl von, in 2D-DIGE-Analysen nur schwer zu erfassenden, Membranproteinen identifiziert und quantifiziert werden. Des Weiteren konnte für die Analyse des Gesamtproteoms ein GeLCMSMS-Ansatz, welcher die Identifizierung und Quantifizierung von etwa 30% aller in P. putida KT2440 kodierter Proteine erlaubt, etabliert werden. Verschiedene Methoden der Proteomanalyse können somit einen wertvollen Beitrag zur biotechnologischen Stammentwicklung und zum Verständnis zellulärer Netzwerke leisten.