Funktion und Dynamik eines gemeinsamen Insertionskomplexes der Sec-Translokase und YidC-Insertase in der bakteriellen Membran

Abstract

YidC/Oxa1/Alb3-insertases and the Sec-translocase are conserved across all three kingdoms of life and constitute the most important pathway for integral proteins into cell membranes and membranes of eukaryotic organelles. The insertion of membrane proteins into the inner membrane of Gram-negative bacteria occurs mainly via the SecYEG-translocase and the YidC-insertase acting independently or in cooperation. For the cooperative insertion a close contact between SecY and YidC is assumed. Previous interaction-studies and a recently solved low-resolution structure of the so-called holo-translocon (14 Å) indicate a contact between the lateral gate of SecY and the hydrophobic substrate slide of YidC. Which specific domains of YidC and SecY thereby interact directly with each other was unknown so far. The aim of this study was to describe the contact between SecY and YidC in more detail. A high affinity for the interaction of the two proteins in detergent and in DOPC-proteoliposomes was determined via FRET measurements with fluorescently labeled SecY and YidC. For the stoichiometric ratio of the SecY/YidC-interaction a factor of one was calculated. To identify the specific contacts between SecY and YidC in vivo disulphide cross-linking experiments were performed. Direct interactions between the transmembrane domain (TM) 3 and TM8 of the SecY lateral gate and TM3 and TM5 of the hydrophobic slide of YidC were found, respectively. Furthermore, a YidC mutant with five serine substitutions, which was unable to rescue a YidC depletion strain, was investigated. Even though the serine positions are located in the middle and the periplasmic half of the hydrophobic slide of YidC and four of the positions are identical with substrate contact sites, no inhibition of insertion for the YidC-dependent substrates M13 procoat and Pf3 coat by the 5S mutant compared to the wildtype YidC was observed. For the YidC-only pathway a minimum of hydrophobicity seems to be required sufficient to allow the insertion of these substrates. In vitro FRET measurements showed an impaired interaction between SecY and the YidC 5S mutant and confirmed once again an involvement of the hydrophobic slide in the SecY/YidC-contact. Based on the cross-linking contacts and the results of the FRET measurements a possible model of the SecY/YidC-contact was established, which shows the SecY lateral gate vis-à-vis of the hydrophobic slide and the hydrophilic groove between TM3 and TM5 of YidC generating a combined SecY/YidC-cavity. Taken together, the present study provides further evidence that the lateral gate of the Sec-translocase directly interacts with the hydrophobic slide of YidC. In a further project, a SecY-YidC fusion protein was cloned to ensure the two proteins are in close proximity, the correct orientation and proper stoichiometry after reconstitution into proteoliposomes. For a collaboration with the ETH Zürich, proteoliposomes hosting the fusion protein, SecYEG, YidC or SecYEG and YidC together were prepared by myself in Hohenheim. The stepwise insertion of the Sec/YidC-dependent substrate LacY into these proteoliposomes was observed by a collaborating group of the ETH Zürich using AFM–based single-molecule force spectroscopy. The insertion of LacY was observed for the different cases but for the fusion protein and SecYEG combined with YidC the insertion process is dominated by the Sec-translocase, whereas YidC probably only has a supporting function in the folding of the protein.

YidC/Oxa1/Alb3-Insertasen und das Sec-Translokon sind über alle drei Reiche des Lebens konserviert und stellen den wichtigsten Weg für integrale Proteine in Zellmembranen und Membranen von eukaryontischen Organellen dar. Die Insertion von Membranproteinen in die innere Membran von Gram-negativen Bakterien erfolgt hauptsächlich über die SecYEG-Translokase und die YidC-Insertase, die unabhängig voneinander oder in Kooperation miteinander agieren können. Für die kooperative Insertion wird ein enger Kontakt zwischen SecY und YidC vorausgesetzt. Aufgrund von früheren Interaktions-Studien und einer kürzlich gelösten Struktur des sogenannten Holotranslokons mit geringer Auflösung (14 Å) wird von einem Kontakt zwischen dem lateral gate von SecY und der hydrophoben Substratrutsche von YidC ausgegangen. Welche konkreten Domänen von YidC und SecY dabei direkt miteinander interagieren, war bisher nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, den Kontakt zwischen SecY und YidC detaillierter zu beschreiben. In vitro wurde über FRET-Messungen mit Fluoreszenzfarbstoff-markiertem SecY und YidC eine hohe Affinität für die Interaktion der beiden Proteine sowohl in Detergens als auch in DOPC-Proteoliposomen ermittelt. Für die Stöchiometrie der SecY/YidC-Interaktion wurde der Faktor eins bestimmt. Um die genauen Kontakte zwischen SecY und YidC zu identifizieren, wurden in vivo Disulfid-Cross-Linking-Experimente durchgeführt. Es konnten direkte Kontakte zwischen der TM3 und TM8 des SecY lateral gates und der TM3 beziehungsweise TM5 der hydrophoben Substratrutsche von YidC gezeigt werden. Zudem wurde eine YidC-Mutante mit fünf Serin-Substitutionen, die den Wachstumsdefekt eines YidC-Depletionsstamms nicht wiederherstellen konnte, charakterisiert. Obwohl die Serin-Positionen alle in der Mitte und der periplasmatischen Hälfte der hydrophoben Rutsche von YidC liegen und vier der Positionen mit Substrat-Kontaktstellen übereinstimmen, konnte keine Inhibierung der Insertion der YidC-abhängigen Substrate M13 procoat und Pf3 coat durch die 5S Mutante im Vergleich zum Wildtyp beobachtet werden. Für die YidC-only Insertion scheint ein Minimum an Hydrophobizität nötig zu sein, das bei dieser Mutante nicht unterschritten wird. In vitro FRET-Experimente zeigten eine gestörte Interaktion zwischen SecY und dieser YidC 5S Mutante und bestätigten damit erneut eine Beteiligung der hydrophoben Rutsche am SecY/YidC-Kontakt. Anhand der ermittelten Cross-Link-Kontakte und der Ergebnisse der FRET-Messungen konnte ein mögliches Kontaktmodell erstellt werden, in dem das SecY lateral gate der hydrophoben Substrat-Rutsche und der sich zwischen TM3 und TM5 öffnenden hydrophilen Tasche von YidC gegenüber steht, wodurch sich eine gemeinsame SecY/YidC-Pore bildet. Die vorliegende Arbeit liefert damit weitere Beweise, dass das lateral gate der Sec-Translokase direkt mit der hydrophoben Substratrutsche von YidC interagiert. In einem weiteren Projekt wurde ein SecY-YidC-Fusionsprotein zur Sicherstellung eines engen Kontakts, der korrekten Orientierung der Proteine zueinander und der richtigen Stöchiometrie in rekonstituierten Proteoliposomen kloniert. Für eine gemeinsame Studie mit der ETH Zürich wurden Proteoliposomen, die das Fusionsprotein, SecYEG, YidC oder SecYEG zusammen mit YidC enthielten, von mir in Hohenheim hergestellt. Die schrittweise Insertion des Sec/YidC-abhängigen Substrats LacY in diese Proteoliposomen wurde von einer Arbeitsgruppe der ETH Zürich mithilfe der AFM-basierten Einzelmolekül-Kraftspektroskopie beobachtet. Die LacY-Insertion wird im Falle des Fusionsproteins und SecYEG in Kombination mit YidC von der Sec-Translokase dominiert, während YidC vermutlich nur eine unterstützende Rolle bei der Proteinfaltung einnimmt.