Investigations on the effects of forage source and feed particle size on ruminal fermentation and microbial protein synthesis in vitro

Abstract

The synthesis of microbial protein in the rumen has a major impact on protein- and amino acid supply in ruminants. The amount and amino acid composition of the protein that enters the small intestine primarily depends on diet formulation. In the present studies the effects of maize silage (MS) and grass silage (GS) on ruminal fermentation and microbial protein synthesis were investigated, considering methodical aspects of in vitro studies, particularly grinding of feed samples. In the first experimental series five mixed diets with different proportions of MS and GS (100:0, 79:21, 52:48, 24:76 and 0:100) and a constant proportion of soybean meal (11%) were used. The content of crude protein (CP) and fibre fractions increased, whereas the content of organic matter (OM) and starch decreased with increasing proportion of GS in the diet. It was hypothesised that a combination of MS and GS can benefit microbial growth and thus fermentation of nutrient fractions to a higher extent than using only one forage source separately. It was also to be investigated how changes in diet composition affect the amino acid profile of microbial protein. A well standardised semi-continuous rumen simulation technique (RUSITEC) was used, which is a commonly accepted experimental model in investigations on ruminal fermentation. Changes in fermentation characteristics, as a result of changing the MS-to-GS ratio, were tested for linear and quadratic effects in order to identify possible associative effects. Prior to the in vitro incubation, feedstuffs were dried and ground. It was aimed to investigate in which way fermentation in the RUSITEC system is influenced by mean feed particle size. Therefore two milling screen sizes (MSS; 1 vs. 4 mm) were used in all diets and results on fermentation characteristic were tested for possible interactions of forage source and MSS. One incubation period lasted for 13 days (6 days adaption period, 7 days sampling period), and each treatment was tested in at least three replicates. Ruminal digesta, obtained from rumen-fistulated wether sheep, was used as the inoculum for starting the incubation. Diets were fed once daily to the RUSITEC system, and nylon feed bags remained for 48 h inside the fermentation vessel. A buffer solution, containing 15NH4Cl, was infused continuously into the vessel and the respective effluent was analysed for short chain fatty acids (SCFA) and NH3-N. Solid- and liquid- associated microbial fractions were isolated from the feed residues, the liquid inside the vessel and the effluent by differential centrifugation. The flow of microbial CP was quantified on the basis of N and 15N balances. The feed residues were analysed for crude nutrients and detergent fibre fractions and the respective degradation rates were calculated. OS and CP in the feed residues were corrected for the contribution of solid-associated microbes. The degradation of OM and fibre fractions, as well as amounts of NH3-N increased linearly with stepwise replacement of MS by GS. Degradation of CP was unaffected by diet composition, as well as total SCFA production. The degradation of OM and CP was higher in coarse milled (4 mm-MSS) than in fine milled (1 mm-MSS) treatments, accompanied by higher amounts of NH3-N and total SCFA. An improvement of growth conditions for some microbial groups, e.g. anaerobe fungi, was discussed. The amount of microbial CP increased linearly by the stepwise replacement of MS by GS, and was higher at 4 mm-MSS than at 1 mm-MSS. The amount of available N was assumed to advance microbial growth in the RUSITEC system. Efficiency of microbial CP synthesis was improved from 29 to 43 mg microbial N per g degraded OM by increasing the proportion of GS in the diet, but was unaffected by MSS. The N content and the profiles of amino acids of the three microbial fractions, as well as the ratio of solid- to liquid-associated microbes were affected by diet composition and MSS. Interactions of forage source and MSS were rare. However, the results indicated interactions between dietary factors and origin of microbial isolate on characteristics of microbial protein synthesis. In order to provide additional information on the nutritional value, the mixed diets were evaluated by two further methods. The total tract digestibility of crude nutrients was determined in wether sheep. The content of metabolisable energy was similar between diets and averaged 11.5 MJ per kg dry matter. The in vitro gas production was measured within 93 h by using a modified Hohenheim gas production test, providing information on kinetics and extent of ruminal fermentation. Cumulative gas production decreased with increasing proportion of GS in the diet. A negative effect of coarse milling on fermentation in the Hohenheim gas production test was confirmed. Across all diets gas production was delayed at 4 mm-MSS compared to 1 mm-MSS. The results from both approaches supported the findings of the RUSITEC study that a stepwise replacement of MS by GS led to a linear response in degradation of nutrients. As indicated by the gas production data, positive associative effects might only occur in the first hours after starting an incubation. When mixed diets are used effects cannot be clearly related to individual diet ingredients. Moreover, in the mixed diets interactions between soybean meal inclusion and forage source or feed particle size cannot be excluded. Therefore pure silages were incubated separately in the RUSITEC system in the second experimental series and three milling screens of different size were used (1, 4 and 9 mm). In accordance with the first experimental series, degradation of OM, fibre fractions and non-structural carbohydrates, production of NH3-N, as well as microbial CP flow and efficiency of microbial CP synthesis were higher in GS than in MS. A higher degradation of CP was found for MS than for GS, indicating interactions between forage source and soybean meal inclusion. An increase in MSS from 1 mm to 9 mm led to an improvement in the degradation of OM, CP and non-structural carbohydrates, particularly of starch in MS, as well as in the microbial CP flow for both silages. But the efficiency of microbial CP synthesis and microbial amino acid profile were less affected by MSS. In the second experimental series additionally the effect of available N on fermentation of MS was investigated. The supplementation of urea-N improved the degradation of non-structural carbohydrates, especially starch, but not that of fibre fractions in MS. The efficiency of microbial CP synthesis was increased from 26 to 35 mg microbial N per g degraded OM by urea-N supplementation to MS. The way of urea administration, either supplied together with the feed once daily or infused continuously by buffer solution, had only marginal effects on fermentation characteristics. It was concluded that microbial growth is improved by degradation of OM from GS compared to MS and by an increasing availability of N in the RUSITEC system. Meaningful associative effects of mixtures of MS and GS on ruminal fermentation characteristics are not likely to occur. However, transferability of results to other batches of MS and GS is limited, as high variations in chemical composition are known for both types of silage. Fermentation of MS- and GS-based diets in the RUSITEC system benefits more by coarse milling at MSS up to 9 mm than by fine milling at 1 mm-MSS. Consequently, variations in MSS and feed particle size distribution have to be taken into account when evaluating feeds by rumen simulation systems. The changes in composition and contribution of microbial fractions give indications to a shift in the microbial community as a result of variation of silage type and feed particle size, but further research on this aspect is needed. Moreover, the present results stated that the origin of the microbial samples is very important for measurements on microbial protein synthesis.

Die Synthese mikrobiellen Proteins im Pansen hat einen entscheidenden Einfluss auf die Protein- und Aminosäurenversorgung der Wiederkäuer. Die Menge und die Aminosäuren-zusammensetzung des am Dünndarm anflutenden Proteins sind vor allem von der Rations-gestaltung abhängig. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Maissilage (MS) und Grassilage (GS) auf die ruminale Fermentation und die mikrobielle Proteinsynthese untersucht. Die Betrachtung methodischer Aspekte, insbesondere der Vermahlungsgrad des Futters, wurde in den vorliegenden in vitro Untersuchungen einbezogen. In der ersten Versuchsreihe (Paper I + II) wurden fünf Mischrationen mit unterschiedlichen Anteilen an MS und GS (100:0, 79:21, 52:48, 24:76 und 0:100) und einem konstanten Anteil an Sojaextraktionsschrot (11%) verwendet. Mit steigendem Anteil an GS in der Ration stieg der Gehalt an Rohprotein (XP) und Faserfraktionen an, wohingegen der Gehalt an organischer Substanz (OS) und Stärke abnahm. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine Kombination von MS und GS das mikrobielle Wachstum und somit den Nährstoffabbau in einem höheren Maße begünstigt als die Verwendung einer einzigen Grundfutterquelle. Zudem sollte geprüft werden, wie sich die Rationsänderung auf das Aminosäurenmuster des mikrobiellen Proteins auswirkt. Es wurde eine gut standardisierte semi-kontinuierliche Pansensimulationstechnik (RUSITEC) genutzt, welche als Modell für Untersuchungen zur Pansenfermentation weitestgehend akzeptiert ist. Die Veränderung der erfassten Fermentationsparameter, als Folge der Änderung des MS:GS-Verhältnisses in der Ration, wurde auf lineare und quadratische Effekte untersucht, um mögliche assoziative Effekte zu identifizieren. Vor der in vitro Inkubation der Futtermittel wurden diese getrocknet und vermahlen. Inwieweit die mittlere Futterpartikelgröße die Ergebnisse im RUSITEC-System beeinflusst, sollte durch eine Variation der Siebweite (SW; 1 vs. 4 mm) bei der Vermahlung geklärt werden. Mögliche Wechselwirkungen von Grundfutterquelle und SW auf die Kenngrößen der ruminalen Fermentation wurden geprüft. Eine Inkubationsperiode dauerte 13 Tage (6 Tage Adaptationsphase, 7 Tage Sammelphase) und jede Behandlung wurde mit mindestens 3 Wiederholungen getestet. Als Startmedium für die Inkubation diente feste und flüssige Phase der ruminalen Digesta von pansen-fistulierten Hammeln. Das Futter wurde dem RUSITEC-System einmal täglich zugeführt und die Nylonfutterbeutel verblieben 48 h im Fermentationsgefäß. Eine mit 15NH4Cl versetzte Pufferlösung wurde kontinuierlich in das System infundiert. In der jeweiligen Überlaufflüssigkeit wurde der Gehalt an kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) und NH3-N bestimmt. Drei Mikrobenfraktionen wurden aus der festen und flüssigen Phase des Systems mittels Differentialzentrifugation isoliert; und zwar aus den Futterresten, aus der Flüssigkeit im Inneren des Fermentationsgefäßes und aus der Überlaufflüssigkeit. Die Menge an mikrobiellem XP, welches das System täglich verließ wurde mittels N- und 15N-Bilanzen bestimmt. Die Futterreste wurden auf ihren Gehalt an Rohnährstoffen und Detergenzien-Faser-Fraktionen analysiert. Der Gehalt an OS und XP in den Futterresten wurde um den jeweiligen Anteil der Partikel-assoziierten Mikroben korrigiert. Der stufenweise Austausch von MS durch GS bewirkte einen linearen Anstieg im Abbau der OS und der Faserfraktionen, sowie in der Menge an NH3-N. Der XP-Abbau und die Gesamt-menge an gebildeten SCFA waren durch die Ration nicht beeinflusst. Eine grobe Vermahlung (4 mm SW) führte im Vergleich zu einer feinen Vermahlung (1 mm SW) zu einer Erhöhung im OS- und XP-Abbau, sowie zu einer erhöhten SCFA-Produktion. Eine Verbesserung der Wachstumsbedingungen für bestimmte Mikrobengruppen, z.B. anaerobe Pilze, wurde diskutiert. Die Menge an mikrobiellem XP stieg linear mit dem Austausch von MS durch GS an und war bei 4 mm-SW höher als bei 1 mm-SW. Es wurde vermutet, dass die Menge an verfügbarem N im RUSITEC-System das mikrobielle Wachstum fördert. Die Effizienz der mikrobiellen XP-Synthese (mg mikrobieller N/g abgebaute OS) stieg mit zunehmendem Anteil an GS in der Ration von 29 auf 43 an, war aber nicht durch die SW beeinflusst. Der N-Gehalt und das Aminosäurenprofil der drei Mikrobenfraktionen, ebenso wie das quantitative Verhältnis von Mikroben der festen und flüssigen Phase zueinander, waren durch die Rationsgestaltung und die SW beeinflusst. Wechselwirkungen von Grund-futterquelle und SW auf die untersuchten Merkmale waren kaum zu beobachten. Allerdings deuteten sich Wechselwirkungen zwischen den beiden Faktoren und der Herkunft der Mikrobenfraktion auf die Parameter der mikrobiellen Proteinsynthese an. Um zusätzliche Informationen zum Futterwert zu erhalten, wurden zwei weitere Methoden zur Evaluierung der Mischrationen herangezogen. Eine Bestimmung der Rohnährstoff-verdaulichkeit bei Hammeln ergab, dass der Gehalt an umsetzbarer Energie zwischen den Rationen ähnlich war und im Mittel 11.5 MJ je kg Trockensubstanz betrug. Zudem wurde in vitro die Gasbildung über 93 h mittels eines modifizierten Hohenheimer Futterwert-Testes gemessen, um Aussagen zur Kinetik und zum Umfang der ruminalen Fermentation zu erhalten. Die kumulative Gasbildung nahm mit steigendem Anteil an GS in der Ration ab. Der negative Einfluss einer gröberen Vermahlung im Hohenheimer Futterwert-Test konnte bestätigt werden. In allen Rationen war die Gasbildung durch eine Erhöhung der SW von 1 mm auf 4 mm vermindert. Die Ergebnisse aus diesen beiden Untersuchungsansätzen untermauerten die Aussage der RUSITEC-Studie, dass ein stufenweiser Austausch von MS durch GS in der Ration zu einer linearen Änderung im Nährstoffabbau führt. Die Ergebnisse zur Gasbildung deuteten darauf hin, dass positive assoziative Effekte nur in den ersten Stunden nach Beginn der Inkubation auftreten. Bei der Verwendung von Mischrationen können Effekte nicht eindeutig einzelnen Futter-komponenten zugeordnet werden. Zudem kann bei den Mischrationen nicht ausgeschlossen werden, dass Wechselwirkungen zwischen dem zugesetzten Sojaextraktionsschrot und der Grundfutterquelle oder der Futterpartikelgröße auftreten. Deshalb wurden in der zweiten Versuchsreihe ausschließlich die beiden Silagen getrennt inkubiert und drei verschiedene SW während der Vermahlung genutzt (1, 4, 9 mm). In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der ersten Versuchsreihe war der Abbau der OS, der Faserfraktionen und der Nichtstruktur-Kohlenhydrate, die Menge an NH3-N sowie der mikrobielle XP-Fluss und die Effizienz der mikrobiellen XP-Synthese bei GS höher als bei MS. Ein höherer XP-Abbau konnte bei MS im Vergleich zu GS festgestellt werden, was Hinweis auf eine Wechsel-wirkung zwischen Grundfutterquelle und der Zulage von Sojaextraktionsschrot gibt. Ein Anstieg in der Siebweite von 1 auf 9 mm führte in beiden Silagen zu einer Verbesserung im Abbau der OS, des XP und der Nichtstruktur-Kohlenhydrate, inbesondere von Stärke in MS, sowie zu einem erhöhten mikrobiellen XP-Fluss. Die Effizienz der mikrobiellen XP-Synthese, sowie das Aminosäurenmuster waren kaum von der SW beeinflusst. In der zweiten Versuchsreihe wurde zusätzlich der Effekt der N-Verfügbarkeit auf die Fermentation von MS untersucht. Die Zugabe von Harnstoff-N führte zu einer Verbesserung im Abbau der Nichtstruktur-Kohlenhydrate, insbesondere der Stärke. Der Abbau der Faser-fraktionen blieb hingegen unbeeinflusst. Die Effizienz der mikrobiellen XP-Synthese erhöhte sich von 26 auf 35 mg mikrobieller N/g abgebaute OS infolge der Harnstoffzugabe. Die Art und Weise der Harnstoffsupplementierung, entweder einmal täglich zusammen mit dem Futter oder als kontinuierliche Infusion über die Pufferlösung, hatte nur marginale Auswirkungen auf die untersuchten Fermentationsparameter. Es wurde geschlussfolgert, dass das mikrobielle Wachstum im RUSITEC-System durch den Abbau der OS aus GS im Vergleich zu MS, sowie durch eine Erhöhung der verfügbaren N-Menge begünstigt wird. Nennenswerte assoziative Effekte auf das Fermentationsgeschehen durch die Kombination von MS und GS in Mischrationen sind nicht zu erwarten. Allerdings ist die Übertragbarkeit dieser Ergebnisse auf andere Silage-Chargen begrenzt, da große Unterschiede in der chemischen Zusammensetzung bestehen können, sowohl bei MS als auch bei GS. Die Fermentation von MS und GS wird durch eine gröbere Vermahlung mit Erhöhung der SW von 1 mm bis auf 9 mm positiv beeinflusst. Infolgedessen sollten Unterschiede in der SW und der Futterpartikelgrößenverteilung bei der Bewertung von Silagen im RUSITEC-System berücksichtigt werden. Die Veränderungen in der Zusammen-setzung und der Mengenanteile der einzelnen Mikrobenfraktionen, als Folge der Variation der Grundfutterquelle und der Futterpartikelgröße, weisen auf eine Verschiebung in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft hin. Zudem bestätigen die vorliegenden Ergebnisse, dass die Herkunft der Mikrobenmasse einen großen Einfluss auf die Bewertung der mikrobiellen Proteinsynthese hat.