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Doctoral Thesis
2009
Untersuchungen zur Bedeutung des Sulfonylharnstoffrezeptors 1 für die Modulation von Apoptose durch 17 beta-Estradiol in rekombinanten HEK (Human Embryonic Kidney) 293-Zellen und in pankreatischen beta-Zellen
Untersuchungen zur Bedeutung des Sulfonylharnstoffrezeptors 1 für die Modulation von Apoptose durch 17 beta-Estradiol in rekombinanten HEK (Human Embryonic Kidney) 293-Zellen und in pankreatischen beta-Zellen
Abstract (English)
The sulfonylurea receptor (SUR) 1 forms the regulatory subunit of pancreatic ATP-sensitive potassium channels (KATP channels) which are essential for triggering insulin secretion in the beta-cell. Insulin secretion is modulated by additional KATP channel-independent pathways and by adaptive variation of beta-cell mass due to apoptosis, proliferation and/or neogenesis of beta-cells. Apoptosis of beta-cells is assumed to be involved in the pathophysiology of diabetes type 1 and 2. Previously it has been shown, that the insulinotropic sulfonylurea glibenclamide and the natural compound resveratrol can induce enhanced apoptosis and that this effect is specifically linked to the expression of SUR1.
In the present work, it has been investigated whether there are substances that are more potent in inducing apoptosis than glibenclamide and resveratrol. Thereby the main focus was put on 17beta-estradiol which shows structural and functional analogies to the ?phytoestrogen? resveratrol. Like resveratrol, this naturally occurring estrogen is able to induce apoptosis in different experimental systems. Furthermore, it is known that 17beta-estradiol is able to decrease KATP channel activity in beta-cells acting as a KATP channel blocker. It is still discussed whether 17beta-estradiol directly interacts with KATP channels or whether it binds to so far unidentified ?non-classical? plasmalemmal estrogen receptors which are linked to KATP channels via an intracellular signaling cascade. In heterologous competition experiments, Ackermann et al. (2008) were able to show that 17beta-estradiol is a specific ligand of SUR like glibenclamide and resveratrol. Obviously SUR1 can act as a ?non-classical? estrogen receptor.
In the present work it was investigated whether 17beta-estradiol induces apoptosis that is specifically linked to the expression of SUR1. Furthermore, the role of the SUR-isoforms SUR1 and SUR2 and of several SUR-mutants in the induction of apoptosis by 17beta-estradiol was investigated. Therefore, experiments were performed with recombinant HEK293-cells expressing the different isoforms of SUR. Cells that were transfected with empty pcDNA expression vector (pcDNA-cells) were used as control cells. By quantification of different apoptotic parameters such as cell detachment, changes in nuclear morphology as well as increased activity of caspase-3, it was shown that 17beta-estradiol induces specific apoptosis in cells expressing SUR1. In cells expressing the pancreatic isoform SUR1, treatment with 17beta-estradiol resulted in massive apoptosis while cells expressing the cardiac isoform SUR2A or the vascular isoform SUR2B as well as sham-transfected control-cells were less affected. Furthermore, 17beta-estradiol is more potent in inducing apoptosis in cells expressing SUR1 than glibenclamide or resveratrol.
The pancreatic KATP channel consists of the regulatory subunit SUR1 and the pore-forming unit Kir6.2. In the present work, it has been proven that this SUR1-dependent effect of 17beta-estradiol was not significantly modified by coexpression with Kir6.2. These data show that apoptosis induced by 17beta-estradiol does not require the existence of functional pancreatic KATP-channels (formed by SUR1 and Kir6.2 subunits). These results provide evidence for an additional function of SUR1 apart from regulating electrical activity of the pancreatic KATP channels. SUR1 might be specifically involved in an adaptive change of the beta-cell mass and could contribute to the regulation of insulin secretion via influencing beta-cell mass. Additional experiments with cells from the clonal beta-cell lines HIT-T15 and RIN-m5F, endogenously expressing SUR1, showed that treatment with 17beta-estradiol can induce apoptosis in these cells.
In pancreatic islet cells from mice aged 20-32 weeks, a clear induction of apoptosis after treatment with 17beta-estradiol was observed. Beta-cells of Langerhans also express SUR1 endogenously. Treatment of islet cells from wildtype mice with 17beta-estradiol resulted in intensive changes in nuclear morphology while islet cells from SUR1 knockout (SUR1KO) mice of the same age as well as untreated or solvent-treated islet cells from wildtype and SUR1KO mice did not show any marked signs of apoptosis. In contrast to islet cells from elderly mice aged 20-32 weeks (male or female), clear anti-apoptotic effects were detected in islet cells from young mice aged 5-7 weeks (male or female) after treatment with 17beta-estradiol. In untreated or solvent-treated islet cells from young mice (male or female) apoptosis was measured to a large extent, which was reduced by treatment with 17beta-estradiol. These results provide evidence that age is obviously an important factor which can influence the effect of 17beta-estradiol. The apoptotic effect of 17beta-estradiol in elderly mice as well as the anti-apoptotic effect in younger mice is specific to the expression of SUR1 as it was missing in experiments with islet cells from SUR1KO mice. During pregnancy, plasma concentrations of 17beta-estradiol in humans markedly increase. In the third trimester of pregnancy, 17beta-estradiol concentrations between approximately 50 and 100 nM can be readily achieved. At this point of time, the concentration of maternal serum 17beta-estradiol can be elevated up to more than 100 times compared to serum concentrations during the normal menstrual cycle (follicular phase: approx. 0.1-1.0 nM; luteal phase: approx. 0.5-2.0 nM). Changes in beta-cell mass mediated by 17beta-estradiol might contribute to the etiology of gestational diabetes mellitus (GDM). GDM is defined as glucose intolerance that appears or is first recognized during the last trimester of pregnancy.
Estron, another endogenously occurring estrogen, also shows the ability to induce apoptosis in HEK293-cells expressing SUR1 as well as in cells from the SUR1 expressing clonal beta-cell lines HIT-T15 and RIN-m5F. However, the extent of apoptosis after treatment with estron is much lower than after treatment with 17beta-estradiol, although estron differs from 17beta-estradiol only in lacking one hydroxyl group. This hydroxyl group seems to be important for this pronounced SUR1-specific induction of apoptosis by 17beta-estradiol.
In the present work, also the role of different SUR-mutants was examined. SUR1(M1289T) is a mutant, in which the amino acid methionine at position 1289 in transmembrane helix 17 (TM17) of SUR1 was exchanged by the corresponding amino acid of SUR2B (threonine). The experiments indicate that the amino acid methionine at position 1289 in TM17 obviously plays an important role in apoptosis which is induced by 17beta-estradiol and is specific for the expression of SUR1. This apoptotic effect after treatment with 17beta-estradiol is abolished by this single mutation.
To investigate whether this apoptotic effect after treatment with 17beta-estradiol was linked to a correct function of the nucleotide binding folds, experiments with the mutants SUR1(R1379C) and SUR1(R1379L) were performed. Both mutations are located in the second nucleotide binding fold of SUR1 and result in an enhanced ATP-hydrolysis at the NBFs. These naturally occurring mutations were found in patients with neonatal diabetes with some of them showing a family history in adult-onset type 2 diabetes or GDM. The expression of these mutants in HEK293-cells leads to a much stronger induction of apoptosis than the expression of SUR1. The observation that apoptosis induced by 17beta-estradiol can be influenced by certain mutations of SUR could be of particular importance for the pathophysiology of diseases like cancer or diabetes. The enhanced activity of caspase-9 in cells expressing SUR1 after treatment with 17beta-estradiol suggests that the mitochondrial pathway might play a major role in this apoptotic process.
Abstract (German)
Der Sulfonylharnstoffrezeptor (SUR) 1 ist die regulatorische Untereinheit pankreatischer ATP-sensitiver Kalium-Kanäle (KATP-Kanäle), welche von großer Bedeutung für die Insulinsekretion der beta-Zelle sind. Neben der Auslösung einer Insulinsekretion über einen KATP-Kanal-abhängigen Weg, wird die Freisetzung von Insulin außerdem durch zusätzliche KATP-Kanal-unabhängige Wege moduliert. Darüber hinaus kann die Menge an freigesetztem Insulin über eine Regulation der gesamten beta-Zellmasse infolge von Apoptose oder Proliferation und/oder Neogenese von beta-Zellen beeinflusst werden. Es wird angenommen, dass Apoptose von pankreatischen beta-Zellen eine Rolle für die Pathophysiologie von sowohl Diabetes Typ 1 als auch Typ 2 spielt.
In vorherigen Arbeiten aus der Arbeitsgruppe konnte nachgewiesen werden, dass der insulinotrope Sulfonylharnstoff Glibenclamid und der Naturstoff Resveratrol unter bestimmten Bedingungen verstärkt apoptotische Prozesse, welche spezifisch an die Expression des SUR1 gekoppelt sind, induzieren können. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob es Substanzen gibt, welche stärker Apoptose in Zellen induzieren können als Glibenclamid und Resveratrol. Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit steht 17beta-Estradiol, welches strukturelle und funktionelle Analogien zu dem ?Phytoestrogen? Resveratrol aufweist. So ist dieses endogen vorkommende Estrogen ebenso wie Resveratrol in der Lage, in verschiedenen experimentellen Zellsystemen Apoptose zu induzieren. Außerdem ist bekannt, dass 17beta-Estradiol bei KATP-Kanälen in beta-Zellen als KATP-Kanal-Blocker wirken kann. Es wird diskutiert, ob 17beta-Estradiol hierzu direkt mit KATP-Kanälen interagiert oder ob diese Substanz an ?nicht-klassische? plasmalemmale Estrogenrezeptoren bindet, welche derzeit noch nicht identifiziert sind und über intrazelluläre Signalkaskaden mit KATP-Kanälen in Verbindung stehen. In der Arbeitsgruppe konnte anhand von heterologen Kompetitionsexperimenten nachgewiesen werden, dass 17beta-Estradiol neben Glibenclamid und Resveratrol ein spezifischer Ligand des SUR ist. Somit kann SUR1 offensichtlich als ?nicht-klassischer? Estrogenrezeptor fungieren.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde überprüft, ob auch 17beta-Estradiol eine Apoptose spezifisch in Zellen induziert, welche SUR1 exprimieren. Außerdem sollte vergleichend die Bedeutung der beiden SUR-Isoformen SUR1 und SUR2 sowie verschiedener SUR-Mutanten bei der Induktion von Apoptose durch 17beta-Estradiol untersucht werden. Hierfür wurden Experimente mit rekombinanten HEK293-Zellen durchgeführt, welche jeweils die verschiedenen SUR-Isoformen exprimieren. Als Kontrollzellen dienten Zellen, welche mit leerem Expressionsvektor transfiziert worden waren (pcDNA-Kontrollzellen). Anhand der Quantifizierung verschiedener Parameter, wie Zellablösung, apoptotische Veränderungen in der Zellkernmorphologie sowie gesteigerte Aktivität des Caspase-3-Enzyms, konnte nachgewiesen werden, dass 17beta-Estradiol Apoptose spezifisch in Zellen induziert, welche SUR1 exprimieren. So wurde in Zellen, welche die pankreatische Isoform SUR1 exprimieren, nach Behandlung mit 17beta-Estradiol eine deutlich stärkere Apoptose gemessen als in pcDNA-Kontrollzellen bzw. Zellen, welche die cardiale Isoform SUR2A oder die vaskuläre Isoform SUR2B exprimieren. Außerdem induziert 17beta-Estradiol in Zellen, welche SUR1 exprimieren, eine deutlich stärkere Apoptose als Glibenclamid oder Resveratrol.
Der KATP-Kanal in beta-Zellen des Pankreas setzt sich aus der regulatorischen Untereinheit SUR1 und der porenbildenden Untereinheit Kir6.2 zusammen. In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die Co-Expression von SUR1 mit Kir6.2 in HEK293-Zellen die durch SUR1 vermittelte Apoptose nach Behandlung mit 17beta-Estradiol kaum beeinflusst. Diese Daten weisen darauf hin, dass die durch 17beta-Estradiol induzierte Apoptose offensichtlich nicht die Existenz funktionsfähiger pankreatischer KATP-Kanäle erfordert. Diese Ergebnisse bestätigen die bisherigen Hinweise, dass der SUR als pankreatischer Rezeptor, neben seiner regulatorischen Funktion in KATP-Kanälen, spezifisch an einer adaptiven Veränderung der beta-Zellmasse beteiligt sein könnte und so zur Regulation der Insulinsekretion über die Beeinflussung der beta-Zellmasse beitragen könnte.
Ergänzend wurden Experimente mit Zellen der klonalen beta-Zelllinien HIT-T15 und RIN-m5F durchgeführt, welche SUR1 endogen exprimieren. Auch in diesen Untersuchungen wurde nachgewiesen, dass die Behandlung mit 17beta-Estradiol in diesen Zellen Apoptose induzieren kann. Eine deutliche Induktion von Apoptose durch 17beta-Estradiol konnte auch in pankreatischen Inselzellen aus Mäusen im Alter von 20-32 Wochen nachgewiesen werden. Auch die beta-Zellen der Langerhans-Inseln exprimieren SUR1 endogen. In Inselzellen aus Wildtyp-Mäusen traten nach der Behandlung mit 17beta-Estradiol starke apoptotische Veränderungen in der Zellkernmorphologie auf, während in Inselzellen aus SUR1-Knockout (SUR1KO)-Mäusen des gleichen Alters ebenso wie in Inselzellen aus Wildtyp- und SUR1KO-Mäusen nach Behandlung mit Lösungsmittel bzw. ohne Behandlung keine deutlichen Anzeichen von Apoptose gefunden wurde. Im Gegensatz zu den Inselzellen aus älteren Mäusen (männlich oder weiblich, 20-32 Wochen alt), können nach Behandlung von Inselzellen aus jungen Mäusen (männlich oder weiblich, 5-7 Wochen alt) mit 17beta-Estradiol deutliche anti-apoptotische Effekte nachgewiesen werden. In Inselzellen aus jungen Mäusen (männlich oder weiblich) wurde nach Behandlung mit Lösungsmittel bzw. ohne Behandlung ein hohes Maß an Apoptose gemessen, welches durch die Behandlung mit 17beta-Estradiol reduziert wurde. Diese Versuchsergebnisse geben wichtige Hinweise darauf, dass das Alter demnach einen wichtigen Faktor darstellt, welcher die Wirkungsweise von 17beta-Estradiol beeinflussen kann. Sowohl der apoptotische Effekt von 17beta-Estradiol in älteren Mäusen als auch der anti-apoptotische Effekt in jüngeren Mäusen ist spezifisch für den SUR1, da er in Experimenten mit Inselzellen aus SUR1KO-Mäusen ausbleibt. Im menschlichen Organismus kommt es während der Schwangerschaft zu einem beträchtlichen Anstieg der Plasmakonzentration an 17beta-Estradiol. Im dritten Schwangerschaftstrimester können Konzentrationen von ungefähr 50 bis 100 nM erreicht werden, was im Vergleich zu den Serumkonzentrationen während des Menstruationszyklus (Follikelphase: ca. 0,1-1,0 nM; Lutealphase: ca. 0,5-2,0 nM) eine Erhöhung um bis zu mehr als das 100-fache bedeuten kann. Durch 17beta-Estradiol vermittelte Veränderungen in der beta-Zellmasse könnten einen interessanten Aspekt im Bezug auf die Entwicklung von Gestationsdiabetes (GDM) darstellen. Bei GDM handelt es sich um eine Glucose-Intoleranz unterschiedlichen Ausmaßes, welche meist erst im letzten Trimester der Schwangerschaft auftritt bzw. diagnostiziert wird.
Ein weiteres endogen vorkommendes Estrogen, das Estron, weist in Experimenten mit HEK293-Zellen, welche SUR1 exprimieren, sowie mit Zellen der klonalen beta-Zelllinien HIT-T15 und RIN-m5F ebenfalls die Fähigkeit auf, eine für die Expression von SUR1 spezifische Apoptose zu induzieren. Das Ausmaß ist allerdings deutlich geringer als nach Behandlung mit 17beta-Estradiol, obwohl sich 17beta-Estradiol von Estron ausschließlich darin unterscheidet, dass am Kohlenstoffatom an Position 17 anstelle einer Carbonylgruppe eine Hydroxylgruppe vorhanden ist. Dieser Substituent scheint somit von Bedeutung für die apoptotische Wirkung dieser Substanzen zu sein. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde außerdem die Bedeutung verschiedener Mutationen im SUR-Gen untersucht. So handelt es sich bei SUR1(M1289T) um eine Mutante, bei der in der Transmembranhelix 17 die Aminosäure Methionin an Position 1289 durch Threonin, die Aminosäure, welche sich bei SUR2B an korrespondierender Stelle befindet, ausgetauscht wurde. Durch diese Punktmutation wurde der für den SUR1 spezifische apoptotische Effekt nach Behandlung mit 17beta-Estradiol komplett aufgehoben, d.h. die Transmembranhelix 17 scheint bei dem apoptotischen Effekt von Bedeutung zu sein.
Um zu untersuchen, ob die durch SUR1 vermittelte Apoptose nach Behandlung mit 17beta-Estradiol an eine korrekte Funktion der Nukleotidbindungsfalten gekoppelt ist, wurden Versuche mit den Mutanten SUR1(R1379C) bzw. SUR1(R1379L) durchgeführt. Beide Mutationen sind in der zweiten Nukleotidbindungsfalte von SUR1 lokalisiert und führen zu einer gesteigerten ATP-Hydrolyse an den NBFs. Diese natürlich vorkommenden Mutationen wurden bei Patienten mit vorübergehendem neonatalem Diabetes gefunden. Die Expression dieser Mutanten in HEK293-Zellen führt nach Behandlung mit 17beta-Estradiol zu einer deutlich stärkeren Induktion von Apoptose als in Zellen, welche SUR1 exprimieren. Da bestimmte Mutationen in SUR1 den Effekt von endogen vorkommendem 17beta-Estradiol beeinflussen könnten, könnten solche Mutationen möglicherweise von großer pathophysiologischer Bedeutung für die Entstehung von Erkrankungen wie z.B. Krebs oder Diabetes sein.
Die Messungen der Aktivität verschiedener Caspase-Enzyme nach Behandlung mit 17beta-Estradiol gaben erste Hinweise darauf, dass der mitochondriale Signalweg bei der durch SUR1 vermittelten Apoptose eine große Rolle spielt.
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Faculty of Natural Sciences
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2009-06-28
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German
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Classification (DDC)
610 Medicine and health
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Sustainable Development Goals
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author = {Ackermann, Stefanie},
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