Comparison of plant cell wall degrading community in the rumen of N’Dama and N’Dama x Jersey crossbred cattle in relation to in vivo and in vitro cell wall degradation

Abstract

This thesis presents a unique combination of an in vivo feeding trial, the analysis of the microbial community structure in the rumen, and in vitro fermentation studies, in order to assess the impact of breeds and diets on animal performance in a West African production setting. Pure N?Dama and N?Dama x Jersey crossbred cattle were fed two basal diets, baby corn and groundnut hay, supplemented with graded levels of either conventional concentrate or moringa leaf meal, to compare animal responses in productivity. In this context, Moringa oleifera leaf meal constitutes a locally available, potential alternative to commercial concentrate for cattle production. The cell wall digesting community of N?Dama and its crosses was analysed using phylogenetically based hybridisation probes to account for the contribution of rumen microbes to differences in fermentation patterns and animal response. In vitro fermentation studies were carried out using the same diets and supplementation levels as fed in vivo, to test the accuracy of the in vitro gas production technique in predicting the optimum level of supplementation. The in vivo feeding experiment focussed on the comparison of breed performance with diets relevant for local production conditions. Six N?Dama and six N?Dama x Jersey (crossbred) animals were used in a cross over design. They were fed consecutively three combinations of roughage and supplement, baby corn stover and concentrate (BCS:Co), groundnut hay and concentrate (GNH:Co) and groundnut hay and moringa meal (GNH:Mo), each at 5 levels of supplementation (0, 10, 20, 30 and 40%). Results from this study showed that there was a clear difference in animal response to different feeding regimes between the two breeds. When averaged over all diets organic matter intake (OMI) was higher in crossbred compared to N?Dama (94 and 87.6 g/kg 0.75 d-1, respectively). When analyzed for the diets and averaged over the breeds OMI was higher when animals were fed the baby corn based diet compared to groundnut based diets (95 against 88 g/kg 0.75 d-1). Only when the diet consisted of BCS:Co, and at low levels of supplementation, N?Dama ingested more than crossbred, but the difference was not significant. With GNH:Co crossbred ingested significantly more at levels of supplementation less or equal to 20%. With GNH:Mo crossbred ingested more, whatever the level of supplementation. The optimum level of supplementation in vivo, estimated with the single slope broken line model, was 10% and 20% for both breeds when they were fed BCS:Co and GNH:Co respectively, but 30% for N?Dama and 10% for the crossbreds when animals were fed GNH:Mo. Organic matter digestibility (OMD) was higher in N?Dama (64.6% against 60.7% in crossbreds) when animals were fed BCS:Co and supplementation had no effect on OMD of BCS:Co whatever the breed. When animals were fed groundnut hay as basal diet, OMD was also significantly higher in N?Dama at low levels of supplementation, but the differences became insignificant beyond 10% and 20% of concentrate or moringa, respectively. With GNH:Co OMD showed a quadratic response (p<0.001) with increasing level of supplementation when it was fed to crossbreds and was not affected when it was fed to N?Dama. Increasing levels of moringa meal supplementation increased OMD in both breeds up to a peak at 20 and 30% for N?Dama and crossbred, respectively. Average daily weight gain (ADG) was not affected by the breed, however it was higher on BCS:Co compared to other diets. On BCS:Co ADG increased with the level of supplementation, reaching a peak at 30%, whereas supplementation had no effect on ADG when animals were fed groundnut hay based diets. As N?Dama could take in and digest more of the low quality BCS:Co diet, they were less efficient in feed conversion under this feeding regime (FCE: 14 vs. 9 for the crossbreds). On GNH based diets, however, N?Dama surpassed the crossbreds in feed conversion efficiency with ratios of 11 vs. 13 for GNH:Co and 9 vs. 27 on GNH:Mo. Rumen microbes play the key role for the digestibility of a given feed and thus also for feed intake and finally animal performance. Obviously, the community composition and activity is highly dependent on the diet. With the present set-up, however, with identical external conditions and three different, well defined diets fed to both, N?Dama and crossbred cattle, a comparison of the microbial community structure between breeds could be attempted. The in vivo and in vitro data taken in the other parts of the study allow a sensible interpretation of potential changes in microbial composition. Rumen fluid was collected from three fistulated N?Dama and three crossbred animals adapted to the experimental diets at medium supplementation level. The cell wall degrading community was analyzed using the phylogenetically based 16S rRNA hybridisation probes. The results showed that on BCS:Co diet the Fibrobacter and R. flavefaciens RNA concentrations were higher in rumen fluid of N?Dama compared to crossbred. These concentrations were also significantly affected by the diet, such that they were higher on baby corn stover compared to groundnut hay based diets. The results of the microbial community analysis suggested that the differences between breeds observed in digestibility could be partially explained by the composition of the cell wall degrading community. Parallel to the in vivo experiment, in vitro fermentation studies were undertaken to evaluate the predictability of the in vivo response to supplementation by the in vitro data. Rumen fluid from 3 N?Dama and 3 crossbred donor animals was used for 24 hour in vitro fermentations. The donor animals were fed consecutively the same three diets used in vivo (BCS:Co, GNH:Co and GNH:Mo) at 20% level of supplementation. Each of these inocula was incubated with in vitro substrates consisting of all the combinations tested in vivo (i.e. 3 diets, 5 levels of supplementation) plus supplement alone. This design should allow to analyze for both, the impact of donor breed as well as that of the donor diet and to conclude which factors may be varied while maintaining predictability. The breed of the donor animals did not significantly affect 24 hour gas production, but short chain fatty acid concentration was higher with rumen fluid from crossbreds when donors were fed BCS:Co and GNH:Mo. Moringa meal as supplement to donor animals changed the fermentation pattern of all the substrates, such that gas production and SCFA increased substantially in groundnut hay based substrates, whereas gas production of BCS:Co substrates decreased and SCFA did not substantially change. In vitro digestibility was higher with rumen fluid from N?Dama whatever the diet of donor animals and the substrate incubated. GNH:Mo as donor diet also increased IVTD of all the substrates. Even though there was no clear response in vivo, this indicates a general stimulation of microbial activity in the rumen and renders moringa leaf meal a promising supplement. Averaged over all data there was a positive correlation (r2=0.53 p<0.001) between IVTD and in vivo OMD. This correlation was much stronger when calculated for a specific diet (e.g. r2=0.90 p<0.001 for BCS:Co, averaged over the breeds). Analyzing the data for the individual breeds affected correlations only to a minor degree. Thus, when testing a supplementation strategy in vitro, it should be important that donor animals are fed the same components (roughage and supplement) that will be combined at different levels in vitro, whilst the breed of donor animals may be of second importance. This work provides conclusive evidence that in vitro incubations may be used to design supplementation strategies, thus reducing the need for in vivo experiments. Moringa leaf meal is a promising local resource to substitute for conventional concentrate. Differences in productivity between breeds could be correlated to (and may be partially manifested through) a divergent community structure of rumen microbes. That, in turn, indicates that animals of different breeds might have a ?genetic background? that favours the establishment of a certain community, even if the animals are kept under identical conditions. This relationship should be investigated by more advanced molecular techniques.

Die vorliegende Arbeit kombiniert mit einem in vivo-Fütterungsexperiment, einer molekularbiologische Analyse der mikrobiellen Populationsstruktur im Pansen, und einer Serie von in vitro-Fermentationsstudien auf einzigartige Weise drei methodische Ansätze, um den Einfluß von Tierrasse und Diät (auf die Rindermast) unter Produktionsbedingungen im westlichen Afrika zu erfassen. Um die Produktivität der Tiere zu vergleichen, wurden reine N?Dama-Rinder und N?Dama X Jersey Kreuzungstiere mit Ernterückständen von babymais (BCS) oder Erdnüssen (GNH) als Grunddiät gefüttert, supplementiert mit steigenden Anteilen von konventionellem Konzentrat oder moringa Blattmehl. Letzteres stellt in diesem Kontext eine lokal verfügbare Ressource dar, die kommerzielles Konzentratfutter ersetzen könnte. Die zellulolytische Population im Pansen der N?Dama und der Kreuzungstiere wurde mittels phylogenetischer 16S rRNA-Sonden analysiert, um den Beitrag der Pansenmikroben zu den Unterschieden im Fermentationsmuster und somit letztlich der Produktivität der Tiere einzuschätzen. Die in vitro-Inkubationen wurden mit denselben Substraten und Supplementen durchgeführt wie der in vivo-Versuch, um zu testen, inwieweit sich die optimale Supplementierungsstrategie aus in vitro-Daten vorhersagen lässt. Im Zentrum des Fütterungsexperimentes stand der Vergleich der Produktivität der beiden Rinderrassen mit verschiedenen, unter den lokalen Bedingungen relevanten Diäten. Sechs N?Dama und sechs Kreuzungstiere wurden in einer Überkreuz-Anordnung eingesetzt. Nacheinander wurden drei Kombinationen von Rauhfutter und Supplement verfüttert, und zwar Babymais und Konzentrat (BCS:Co), Erdnussheu und Konzentrat (GNH:Co), und Erdnussheu mit moringa Blattmehl (GNH:Mo), jeweils in 5 Supplementationsstufen (0, 10, 20, 30 und 40%). Die Ergebnisse dieser Studie zeigen unter allen Fütterungsstrategien einen klaren Unterschied zwischen den Rassen im Masterfolg. Über alle Diäten gemittelt, war die Aufnahme der organischen Substanz (OMI) bei Kreuzungstieren höher als bei den N?Dama (94 versus 87.6 g/kg 0.75 d-1). Im Vergleich der Diäten und über die Rassen gemittelt, war die OMI für die auf Babymais basierenden Diäten höher als für die auf Erdnussheu basierenden (95 versus 88 g/kg 0.75 d-1). Nur von der Kombination Babymais-Konzentrat und auf niedrigen Supplementierungsstufen nahmen die N?Dama mehr auf als die Kreuzungstiere, aber dieser Unterschied war nicht signifikant. Wurden Erdnussheu-Konzentrat Mischungen mit 20% Supplement oder weniger angeboten, nahmen die Kreuzungstiere signifikant mehr Futter auf. Erdnussheu-Moringa Mischungen wurden unabhängig von der Supplementierung von den Kreuzungstieren besser aufgenommen. Die optimale Supplementierungsstufe in vivo, geschätzt nach dem ?single slope broken line?-Modell, lag für beide Rassen bei 10% bzw. 20% für BCS:Co und GNH:Co. Mit GNH:Mo wurden Rasse-bedingte Unterschiede sichtbar indem das Optimum für N?Dama bei 30% lag, aber bei 10% für die Kreuzungstiere. Die Verdaulichkeit der organischen Masse (OMD) war in N?Dama höher, wenn BCS:Co verfüttert wurde. Bei dieser Diät hatte die Supplementierung, unabhängig von der Rasse, keinen Einfluß auf die OMD. Mit Erdnussheu als Grundfutter und auf niedrigen Supplementierungsstufen war die OMD ebenfalls bei den N?Dama höher, diese Unterschiede waren jedoch mit mehr als 10% Konzentrat oder 20% moringa in der Diät nicht mehr signifikant. In den GNH:Co-Kombinationen zeigte die OMD bei den Kreuzungstieren mit steigendem Supplementanteil einen quadratischen Verlauf (p<0.001), während sie bei den N?Dama nicht beeinflusst war. Eine steigende Supplementierung mit moringa Blattmehl auf GNH erhöhte die OMD in beiden Rassen bis zu einem Optimum bei 20% für N?Dama und 30% für die Kreuzungstiere. Der durchschnittliche tägliche Zuwachs (ADG) unterschied sich nicht zwischen den Rassen, war aber mit BCS:Co höher als mit den anderen Kombinationen. Auf BCS:Co stieg der ADG mit der Supplementierunsstufe bis zu einem Maximum bei 30%, während die Supplementierung bei den anderen Diäten keinen Einfluß auf den ADG hatte. Da die N?Dama von der Diät niederer Qualität (BCS:Co) aufnehmen und verdauen konnten, waren sie unter diesem Fütterungsregime weniger effizient in der Futterverwertung (FCE: 14 versus 9 bei den Kreuzungstieren). Mit Erdnussheu als Grundfutter übertrafen hingegen die N?Dama die Kreuzungstiere hinsichtlich der Verwertungseffizienz mit Koeffizienten von 11 versus 13 für GNH:Co und 9 versus 27 für GNH:Mo. Die Pansenflora spielt eine Schlüsselrolle für die Verdaulichkeit eines Substrates und somit letztlich auch für die Futteraufnahme und die Produktivität der Wiederkäuer. Die Zusammensetzung der mikrobiellen Population ist in erster Linie abhängig von der Diät. Der hier gewählte Ansatz jedoch, in dem unter identischen Haltungsbedingungen drei verschiedene, gut definierte Diäten an zwei verschiedene Rinderrassen verfüttert wurden, erlaubt einen Vergleich der Populationsstruktur zwischen den Rassen. Die in vivo und in vitro Daten, die in den anderen Teilen der Studie erhoben wurden, ermöglichen eine sinnvolle Interpretation der molekularbiologischen Befunde zu den Populationsgrößen. Pansensaftproben wurden von jeweils drei fistulierten Tieren beider Rassen gesammelt, die an die experimentellen Diäten auf mittlerem Supplementierungsniveau angepasst waren. Membranhybridisierungen mit 16S rRNA-Sonden für unterschiedliche phylogenetische Gruppen wurden benutzt, um die zellulolytische Population zu analysieren. Es konnte gezeigt werden, dass auf der BCS:Co-Diät die Konzentration von Fibrobacter- und R.flavefaciens-RNA im Pansensaft der N?Dama höher war als bei den Kreuzungstieren. Auch in Abhängigkeit von der Diät war die Konzentration dieser Gruppen auf BCS Grundlage stets höher als auf den GNH basierten Diäten. Diese Befunde korrelieren gut mit der Beobachtung, dass die N?Dama die BCS-Diäten besser verdauen konnten als die Kreuzungstiere. Es liegt also nahe, dass die Pansenflora einen signifikanten Beitrag zu den in vivo beobachteten Unterschieden leistet. Parallel zum Fütterungsexperiment wurden in vitro Fermentationsstudien ausgeführt, um zu testen, inwieweit sich der Supplementierungseffekt in vivo aus in vitro-Daten vorhersagen lässt. Hierzu wurde Pansensaft von 3 N?Dama und 3 Kreuzungstieren für 24 Stunden inkubiert. Die Spendertiere erhielten nacheinander die auch in vivo verfütterten Diäten (BCS:Co, GNH:Co und GNH:Mo) mit jeweils 20% Supplement. Jedes dieser Inocula wurde mit allen in vivo getesteten Kombinationen (d.h. 3 Diäten mit je 5 Supplementierungsstufen) inkubiert und mit dem Supplement allein. Dieser Ansatz erlaubt eine Analyse der Daten sowohl hinsichtlich des Einflusses der Rasse als auch der Diät der Spendertiere, und somit Rückschlüsse darauf, welche Faktoren (in welchem Ausmaß) variabel sein dürfen, ohne die Vorhersagbarkeit zu beeinträchtigen. Die Rasse des Spendertieres hatte keinen signifikanten Einfluß auf die 24h Gasproduktion; die Fettsäuren-Konzentration war jedoch mit dem Pansensaft der Kreuzungstiere erhöht, wenn die Spender BCS:Co oder GNH:Mo gefressen hatten. Moringa-Blattmehl als Supplement in der Donor-Diät veränderte das Fermentationsmuster aller Substrate, so dass Gas und Fettsäureproduktion aus Substraten mit GNH Grundlage deutlich erhöht waren, während aus BCS:Co weniger Gas freigesetzt wurde und die Fettsäuren unverändert blieben. Die in vitro Verdaulichkeit (IVTD) war mit Pansensaft von N?Dama stets höher, egal welche Donor-Diäten gefüttert und welche Substrate inkubiert wurden. Auch mit GNH:Mo als Donor-Diät war die IVTD aller Substrate erhöht. Obwohl die Supplementierung mit moringa in vivo keine eindeutigen Effekte erzielt hatte, deutet letzteres auf eine allgemeine Stimulation der mikrobiellen Aktivität im Pansen hin, und somit auf ein hohes Potential von moringa-Blattmehl als Alternative zu herkömmlichem Konzentratfutter. Über alle Daten gemittelt, gab es eine positive Korrelation zwischen IVTD und in vivo OMD (r2=0.53 p<0.001). Diese war noch deutlicher, wenn wenn sie für eine spezifische Diät-Substrat Kombination berechnet wurde (z.B. r2=0.90 p<0.001 für BCS:Co, gemittelt über die Rassen). Eine Analyse hinsichtlich der Tierrasse beeinflußte die Korrelationskoeffizienten nur unwesentlich. Um eine Supplementationsstrategie in vitro zu testen, sollte also das Spendertier möglichst mit denselben Komponenten gefüttert werden, die in vitro in unterschiedlichen Mischungsverhältnissen inkubiert werden, während die Rasse des Spendertieres weniger kritisch ist. Diese Arbeit belegt anhand schlüssiger Daten, dass in vitro-Inkubationen herangezogen werden können, um Supplementierungsstrategien zu entwerfen, und so den Umfang von in vivo Experimenten deutlich reduzieren können. (insbesondere wenn fistulierte Spendertiere derselben Rasse zur Verfügung stehen und Komponenten der Spenderdiät den zu testenden Substraten entsprechen?). Moringa Blattmehl ist eine vielversprechende, lokal verfügbare Alternative zu konventionellem Konzentratfutter. Unterschiede in der Produktivität zwischen zwei Rassen wurden mit einer divergenten Populationsstruktur der Pansenflora korreliert, die somit wohl zur Manifestation der Unterschiede beiträgt. Dies wiederum könnte man als Hinweis darauf interpretieren, dass es abhängig von der Rasse eine genetische Disposition für die Ausbildung einer typischen Pansenpopulation gibt, selbst wenn Tiere unter identischen Bedingungen gehalten werden. Diese Beziehung sollte mit molekularen Methoden, die ein höheres Auflösungsvermögen haben, weiter untersucht werden.