Untersuchungen zum asexuellen Gentransfer bei biotrophen Oomyceten anhand der Fallbeispiele Plasmopara halstedii und Peronospora tabacina

Abstract

Evidence for gene transfer during the asexual life cycle of certain biotrophic oomycetes was searched for in this study in order to evaluate the potential impact of such parasexual recombination on the variability of these important plant pathogens. Therefore, two case studies with Plasmopara halstedii, the causal agent of sunflower downy mildew, and with the tobacco blue mould pathogen, Peronospora tabacina, were conducted. Although the life cycles of both pathogens lack the possibility of genetic recombination, the organisms differ significantly in their variability. Using molecular methods, several indications for interspecific parasexual recombination between the near relatives Plasmopara halstedii and Plasmopara angustiterminalis were found, giving a possible explanation for the unexpected variability of these pathogens. Asexually formed offspring from dual infection experiments with the two Plasmopara species showed pheno- and genotypic parental traits in new combination and could be cultivated under double selective pressure. The recombinant strain ?R? was studied over 30 generations. Up to the 9th generation and after single sporangium infection, nuclear and mitochondrial traits of both parents were detected in ?R?, indicating a heterokaryon with nuclei and mitochondria of both parental strains. Starting with the 10th generation only fungicide-resistance remained as Pl. halstedii-specific trait, whereas all other detected signals were Pl. angustiterminalis-specific, which indicated true genetic recombination. As one possible mechanism for the genetic exchange it was shown that nuclei can be exchanged between neighboured hyphae via anastomoses and that more than one nucleus can be distributed into one developing sporangium. To prove anastomoses between the different Plasmopara species, specific optical labelling of the participating hyphae is a prerequisit. However, only transient expression of an optical marker gene was achieved, yet. Additional experiments for establishing a stable transformation system were conducted, but were not yet successful in selecting transgenic strains. In contrast to the study on Plasmopara, there was no evidence for recombination in Peronospora tabacina. Neither anastomoses nor heterokaryotic sporangia were found throughout the study. The results are concordant with the findings that tobacco blue mould shows very low variability and that only two phenotypes are known so far from studies in Europe. As the two types of the pathogen, which differ in fungicide sensitivity, did not interact during parallel infection of the same host tissue, they were characterized in detail. Several new pheno- and genotypic differences could be revealed, showing the genetic distance between the two types of the pathogen. A simple PCR detection system to differentiate the two genotypes was created and more than 50 European isolates of tobacco blue mould were monitored.

In der vorliegenden Arbeit sollte nach Hinweisen für genetischen Austausch im asexuellen Lebenszyklus bei ausgewählten Vertretern obligat biotropher Oomyceten gesucht werden, um den Einfluss solcher Rekombinationsmöglichkeiten auf die Variabilität dieser wichtigen Gruppe der Pflanzenpathogene einschätzen zu können. Es wurden dabei zwei Fallstudien am Falschen Mehltau der Sonnenblume, Plasmopara halstedii, und dem Erreger des Tabak-Blauschimmels, Peronospora tabacina einander gegenübergestellt. Die beiden Pathogene weisen in ihrem Lebenszyklus keine bekannten Rekombinationsmöglichkeiten auf, unterscheiden sich aber deutlich hinsichtlich ihrer Variabilität. Mit molekularbiologischen Methoden konnten zahlreiche Hinweise auf eine interspezifische parasexuelle Rekombination zwischen den nah verwandten Plasmopara-Spezies Pl. halstedii und Pl. angustiterminalis gefunden werden, die die überraschende Variabilität dieser Erreger erklären könnten. Ein unter Ausschluss sexueller Vermehrung aus einem Dualinfektionsansatz nach doppelter Selektion gebildeter Tochterstamm wies phäno- und genotypische Eigenschaften der beiden Kreuzungspartner in neuer Kombination auf. Der rekombinante Tochterstamm wurde über mehr als 30 Generationen beobachtet und zeigte zunächst ein additives Verhalten von Zellkern- und mitochondrialen Merkmalen, was auf ein Heterokaryon mit Zellkernen beider Elternstämme schließen ließ. Ab der zehnten Generation waren nur noch Pl. angustiterminalis-spezifische Signale detektierbar, obwohl die Fungizid-Resistenz als Pl. halstedii-spezifisches Merkmal immer noch vorhanden war. Dies ließ echte genetische Rekombination vermuten. Es wurden zudem bei Pl. halstedii der Übertritt von Zellkernen durch Anastomosen in benachbarte Hyphen sowie die Weitergabe von mehr als einem Zellkern an mitotisch gebildete Sporangien gezeigt. Beide Erkenntnisse legen die Möglichkeit der postulierten heterokaryontischen Nachkommen dar, die genetisches Material beider Interaktionspartner besitzen. Für den endgültigen Nachweis von Anastomosen zwischen unterschiedlichen Plasmopara-Spezies muss eine spezifische optische Markierung der beteiligten Hyphen erfolgen. Zu diesem Zweck wurden Versuche für ein stabiles Transformationssystem durchgeführt, das über die bisher erreichte transiente Expression der eingebrachten Marker hinaus eine stabile Veränderung obligat biotropher Oomyceten ermöglichen könnte. Eine erfolgreiche Transformation wurde jedoch nicht erreicht. Bei Peronospora tabacina, dem Erreger des Tabak-Blauschimmels, konnten im Gegensatz zu der Plasmopara-Studie keine Hinweise auf Rekombination im asexuellen Lebenszyklus gefunden werden. Auch Anastomosen als mögliche Strukturen zum Austausch genetischen Materials zwischen zwei Pathogen-Stämmen wurden nicht nachgewiesen. Diese Resultate stützen den Befund, dass Per. tabacina nur wenig variabel ist, werfen aber die Frage auf, warum es zwischen den beiden bisher bekannten Typen des Erregers trotz paralleler Infektion desselben Wirts nicht zu Interaktionen kommt. Daher wurden die beiden Phänotypen, die sich in ihrer Fungizid-Resistenz unterscheiden, näher charakterisiert, und es konnten neue phäno- und genotypische Unterscheidungsmerkmale gefunden werden, die die Distanz zwischen den beiden Erreger-Typen verdeutlichen und nahe legen, dass es sich bei den beiden Typen eventuell um verschiedene Pathogene handelt. Es wurde zudem ein einfaches Nachweissystem geschaffen, mit dem in einem europäischen Monitoring alle verfügbaren Isolate eindeutig einem der beiden Typen von Per. tabacina zugeordnet werden können.