Transcriptomic analyses during infectious anemia in pigs

Abstract

Mycoplasma suis (M. suis) is a uncultivable hemotrophic bactreia parasiting red blood cells in pigs and a small range of other animals. It becomes more and more important because of leading to big economic losses in swine industry. M. suis causes anemia in pigs and is accompanied with other immunosuppressive diseases. A once infected animals is a life-long carrier and could infect other animals as well. To date, there is less information about the pathogenesis and reproduction of the bacteria and it is not possible to cultivate M. suis in vitro. One objective of the present study was to get more information about the transcriptomic changes in a pig during an infection course. Therefore, 3 splenectomized piglets were infected with the highly virulent strain KI_3806. After 2, 4 and 8 days post infection (p.i.) blood samples were taken and total RNA of blood was extracted. Microarray analyses were performed with a commercial Affymetrix array. Using microarrays more than 7000 DE genes from infected pigs could be detected. With M. suis in its host cells – the erythrocyte – we had a perfect model showing molecular interactions or signaling pathways in the M. suis infection process. With the help of the Ingenuity pathway analyses service many genes involved in immune and inflammatory response were found. Moreover typical genes involved in anemia, psoriasis and endothelial cell damage could be observed. The detection of these genes verified the depression and alteration of the immune system by M. suis resulting in evading the immune system and therefore in persisting among the organism. Another aim was to go deeper on the transcriptional level of M. suis and to get insights of the behavior of the bacteria at the time point of and after infection. RNA Sequencing was performed on a HiSeq 2000 Genome Analyzer from Illumina an resulting reads were mapped to reference sequences M. suis KI_3806 and Sus scrofa. Moreover, differential expression analysis was performed using the edgeR package. After mapping, it could be observed that on day 4 p.i. M. suis transcripts seem to be overlapped by porcine transcripts, whereas on day 8 p.i. most of the reads could be allocated to the M. suis genome resulting in almost all M. suis genes were found to be transcribed at the end of infection. When looking at the COG categories the group of proteins with “unknown function” (hypothetical proteins) represented the largest group on both days. Also a high number within the differentially expressed genes were hypothetical genes showing that these genes play an important role during infection. Further investigations are needed to confirm that the hypothetical genes also are involved in M. suis replication and recombination. In conclusion, our analysis revealed several thousand genes differentially expressed during acute IAP and numerous altered pathways and cellular processes throughout the course of host response to acute M. suis infections, thus contributing to a better understanding of the IAP pathogenesis. Moreover, this could lead to new approaches towards cultivation of M. suis as well as therapeutic treatments.

Mycoplasma suis (M. suis) gehört zu den unkultivierbaren hemotrophen Bakterien, welche die roten Blutkörperchen von Schweinen und anderen Tierarten parasitieren. Die Krankheit beginnt zunehmend an Bedeutung, da mit ihr hohe wirtschaftliche Verluste in der Schweinproduktion einhergehen. M. suis verursacht Anämien in Schweinen und wird zudem von anderen immunsuppresiven Krankheiten begleitet. Ein einmal infiziertes Tier bleibt sein Leben lang Träger des Erregers und kann so andere Tiere infizieren. Zum jetzigen Zeitpunkt gibt es kaum Information zur Pathogenese und zu Vermehrungsstrategie von M. suis. Außerdem lässt sich das Bakterium noch nicht in vitro kultvieren. Ein Ziel dieser Studie war es mehr Informationen über die transkriptionellen Änderungen während einer Infektion auf der Wirts-, als auch auf der Erregerseite zu erhalten. Dafür wurden drei splenektomierte Schweine mit dem hoch infektiösen Stamm KI_3806 via subkutaner Blutinjektion infiziert. Es wurde jeweils nach 2, 4 und 8 Tagen Blut entnommen und die Gesamt RNA des Blutes isoliert. Dann wurden Microarray Analysen mit einem kommerziellen Array von Affymetrix durchgeführt, wodurch 7000 differentiell exprimierte Gene in den infizierten Schweinen gefunden werden konnten. Durch das Tiermodell dieser Studie konnten die Signalwege und molekularen Einblicke während einer M. suis Infektion perfekt nachgestellt werden. Das Programm Ingenuity Pathway Analyses zeigte, dass viele dieser Gene an der „Immune und inflammatory response“ beteiligt sind. Darüber hinaus konnten Gene gefunden werden, die unter anderem für die Anämie, für Psoriasis und die Endothelzellschädigung verantwortlich sind. Die Auswertung dieser Gene bestätigt die Aussage, dass M. suis das Immunsystem unterdrückt. Dadurch kann M. suis dem Immunsystem entgehen und wird nicht von diesem eliminiert, was die Persistenz des Erregers erklärt. Ein weiteres Ziel lag darin einen tieferen Einblick in die Transkriptionsebene des Erregers während einer Infektion zu erhalten. Dafür wurde eine RNA-Sequenzierung auf einem HiSeq 2000 Genome Analyzer von Illumina durchgeführt. Die gemessenen „reads“ wurden anschließend gegen das M. suis KI_3806 und das Sus scrofa Genom gemappt. Anschließend wurde eine differentielle Expressionsanalyse mittels dem edgeR Paket durchgeführt. Nach dem Mappen der Gene konnte festgestellt werden, dass die M. suis Transkripte an Tag 4 nach der Infektion von den Schweinetranskripten überlagert werden. Wohingegen an Tag 8 nach der Infektion die meisten Transkripte dem M. suis Genom zugeordnet werden konnten. Nahezu alle Gene konnten an Tag 8 am Ende der Infektion transkribiert werden. Auffälligerweise konnten die meisten Gene Proteinen mit „unknown function“ zugeordnet werden. Auch innerhalb der differentiell exprimierten Gene haben wir eine große Anzahl an hypothetischen Genen gefunden, was beweist, dass sie eine große Rolle während einer Infektion spielen. Weitere Studien sind notwendig um zu bestätigen, dass die hypothetischen Gene auch an der Vermehrung und Replikation von M.suis beteiligt sind. Durch die Transkriptionsanalysen dieser Studie konnten einige tausend differentiell exprimierte Gene während einer M. suis Infektion gefunden werden, ebenso wurden zahlreiche Signalwege und zelluläre Prozesse im Hinblick auf eine Immunantwort gegen M. suis aufgezeigt. Diese neuen Einblicke bringen uns ein Stück näher die Pathogenese der infektiösen Anämie der Schweine zu verstehen und neue Ansätze für ein Kultursystem und Behandlungsstrategien zu entwickeln.