Entwicklung und Charakterisierung verschiedener humaner 3D Fettgewebemodelle mit und ohne Hydrogelmatrix als in vivo nahe Alternative

Abstract

Humanes Fettgewebe sekretiert hunderte regulatorisch aktive Hormone, die bei der Entstehung und Manifestierung schwerwiegender Krankheiten wie Diabetes oder kardiovaskulären Erkrankungen beteiligt sind. Um die Vorhersagekraft von in vitro Modellen zu verbessern und die Komplexität des nativen Fettgewebes besser nachzubilden, werden dringend dreidimensionale (3D) in vivo nahe Fettgewebemodelle benötigt. Um solch ein flexibel anwendbares möglichst physiologisches Modell aufzubauen wurde in dieser Arbeit der Aufbau und die Evaluierung verschiedener 3D Fettgewebemodelle teils mit artifizieller Matrix angestrebt und im Anschluss mit dem nativen Zustand vergleichen. Beginnend wurden aus primärem humanem Fett Lobuli in verschiedenen Größenbereichen isoliert, kultiviert und der Zelltod sowie Zeichen der Lipolyse bestimmt. Es hat sich gezeigt, dass Lobuli mit einem Gewicht von 27 – 70 mg über 15 Tagen die stabilsten Ergebnisse geliefert haben und wurden somit tiefergehend analysiert. Bei der Analyse der Viabilität und Zellfunktionalität in Form der Lipidakkumulation und der Expression von Perilipin A konnte bewiesen werden, dass Lobuli als Fettgewebemodell genutzt werden können. Als weiteres Modell erfolgte die Etablierung von Sphäroiden aus humanen primären Stammzellen aus dem Fettgewebe (adipose-derived stem cells, ASC). Die Sphäroide wurden für 14 Tage adipogen differenziert und währenddessen die Veränderung des Volumens und der Rundheit sowie die Expression von Zelltodmarkern und das adipogene Differenzierungspotenzial betrachtet. Dabei haben Sphäroide mit mehr als 100.000 Zellen ihr Volumen über die Zeit verkleinert und Apoptose- und Nekrosemarker an den Tagen 0 und 14 gezeigt. Sphäroide bis 100.000 Zellen haben ihr Volumen während der Differenzierung leicht vergrößert und haben die meisten Lipide akkumuliert, Perilipin A und Kollagen Ⅵ exprimiert. Somit konnten ASC-basierte Sphäroide aus 10.000 Zellen, mit signifikanter Lipidzunahme, als weiteres Fettgewebemodell mit hohem Potenzial identifiziert werden. Im Anschluss erfolgte die Etablierung von methacrylierter Gelatine (GelMA) als Biomaterial für die Verkapselung von primären ASCs und reifen Adipozyten (adipocyte, AC) mit anschließendem extrusions-basierten 3D Druck. Es konnte gezeigt werden, dass die homogene Verteilung der lipidgefüllten ACs in eine wässrige Biotintenlösung nur durch schnelles Herunterkühlen auf Eis möglich war. Der anschließende 3D Druck hatte, weder auf die Viabilität noch Funktionalität bzw. adipogene Differenzierung der Zellen signifikante Einflüsse. Die additiv aufgebauten Modelle wiesen an Tag 1 und 8 bzw. 15 in der Lebend-Tot-Färbung keinen vermehrten Zelltod im Vergleich zu den manuellen Modellen auf. Die Färbung der intrazellulären Lipide und Perilipin A sowie die Glycerolfreisetzung als Funktionalitätsmarker, haben dies bestätigt. Im Vergleich zu nativem Gewebe haben differenzierte ASCs (diffASC) nach der Differenzierung signifikant weniger lipidpositive Zellen und freigesetztes Glycerol gezeigt. Auch morphologisch betrachtet, haben ACs in GelMA mehr Ähnlichkeiten zum nativen Gewebe als diffASCs. Aufgrund der begrenzten Langzeitstabilität von GelMA, des Ursprungs und der Vernetzung wurden Biomaterialien ohne tierischen Ursprung evaluiert. Dabei hat sich das niedrig acetylierte Polysaccharid Gellan Gum (GG) als vielversprechendes Material erwiesen. Es konnten stabile und transparente Hydrogele durch die Vernetzung mit divalenten Ionen im Zellkulturmedium aufgebaut werden. Die 1 %-igen Hydrogele waren weder bei indirekter noch direkter Testung zytotoxisch oder haben Monozyten aktiviert. Bestätigt wurde es durch die Laktatdehydrogenase (LDH)-Freisetzung, den Resazurinumsatz und eine Lebend-Tot-Färbung. Azelluläre Gele wurden über 98 Tagen ohne signifikante Veränderungen erhalten und zeigten für Fettgewebe geeignete Materialeigenschaften. Aufgrund dieser Langzeitstabilität konnten diffASCs für 98 Tage in GG kultiviert werden und zu univakuolären Fettzellen reifen. Dies wurde durch die Färbung von intrazellulären Lipiden und Perilipin A sowie der Leptinsekretion und Glycerolfreisetzung bewiesen. Verglichen mit nativem Gewebe wiesen die diffASCs eine vergleichbare, wenn auch kleinere Morphologie, ähnliche Anteile an lipidpositiven und univakuolären Zellen auf. Auf Basis von GG konnten ACs erfolgreich verkapselt und aufgebaut werden. Hierbei erwies sich eine GG Konzentration von 0,5 % als geeignet, da homogen gemischte Hydrogele mit hohem Resazurinumsatz und geringer Glycerolfreisetzung kultiviert werden konnten. Für den additive Aufbau der GG-basierten Modelle, fand eine Optimierung zur Biotinte statt, was durch die initiale Zugabe divalenter Ionen zur Erhöhung der Viskosität und damit Druckbarkeit ermöglicht wurde. Die additiv gefertigten Modelle zeigten keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf Viabilität oder Funktionalität. Nach 32 Tagen in Kultur konnten univakuoläre und funktionale Zellen gezeigt werden. Durch die Erhöhung der GG Konzentration auf 1,5 % wurde ein erfolgreiches 6D Bioprintingverfahren etabliert. Auch hier zeigten die in GG verkapselten ASCs keine Viabilitäts-, Morphologie-, oder Differenzierungsunterschiede nach dem Druckprozess. Abschließend erfolgte ein Vergleich der etablierten Modelle wobei die Adipogenese der ASC-basierten Modelle und zum anderen der adipozytenspezifische Phänotyp evaluiert wurde. Hinsichtlich der Viabilität konnten keine Unterschiede festgestellt werden. Das adipogene Differenzierungspotenzial zeigte sich am stärksten im diffASC Hydrogel. Sowohl hier als auch in den Sphäroiden konnten eingelagerte Lipide ohne hormonelle Induktion mit Medium nachgewiesen werden. Die Betrachtung der adipozytenspezifischen Morphologie der ausgereiften Modelle erlaubte den Rückschluss, dass die Zellen in den Monolayern den unausgereiftesten Zustand in Form von multivakuolären, elongierten diffASCs mit Aktin-Stressfasern aufweisen. Die Zellen der anderen Modelle zeigen deutlich größere Lipidvakuolen mit einem abgerundeten Zytoskelett. Die quantitative Bestimmung der Lipid-, Leptin- und Glycerolmenge legt nahe, dass sich die Zellen, außer die im Monolayer, in einem Steady-State befinden, was die relative Genexpression adipozytenspezifischer Gene untermauert. Zusammengefasst wurden in dieser Arbeit sechs unterschiedliche Fettgewebemodelle entwickelt und mit nativem Gewebe verglichen. Jedes Modell weist individuelle Stärken auf, wodurch sich der Anwendungsbereich und die Forschungsfragen unterscheiden. Um ein möglichst in vivo-nahes Modell zu erreichen, sind diffASCs in GG Hydrogelen ein vielversprechendes, langzeitstabiles, ausgereiftes Fettgewebemodell und können daher als flexible Plattform für in vitro Testungen genutzt werden.

Human adipose tissue secretes hundreds of regulatory active hormones involved in developing and manifesting severe diseases such as diabetes or cardiovascular disorders. To improve the predictive power of in vitro models and mimic the complexity of native adipose tissue more closely, three-dimensional (3D) in vivo near adipose tissue models are urgently needed. This work aimed to construct and evaluate different 3D adipose tissue models with and without artificial matrix and compare them with the native state to build a flexible and physiological model. For this purpose, lobules from human primary adipose tissue in different size ranges were isolated, cultured, and signs of cell death or lipolysis were determined. Lobules weighing 27 – 70 mg were found to provide the most stable results over 15 days and were thus investigated more deeply. Analysis of viability and cell function in terms of lipid accumulation and expression of perilipin A proved that lobules were an adequate adipose tissue model. A further model without an artificial matrix were spheroids from human adipose-derived primary stem cells (ASC). The spheroids were adipogenically differentiated for 14 days, and meanwhile, the change in volume and roundness, as well as the expression of cell death markers and the adipogenic differentiation potential, were observed. Here, spheroids with more than 100,000 cells decreased their volume over time and showed apoptosis and necrosis markers at days 0 and 14. Spheroids up to 100,000 cells slightly increased their volume during differentiation. Spheroids from 10,000 cells accumulated the most lipids, expressed perilipin A and collagen Ⅵ. Thus, ASC-derived spheroids from 10,000 cells were identified as another adipose tissue model with high potential. Subsequently, gelatin methacryloyl (GelMA) was established as a biomaterial for the encapsulation of primary ASCs and mature adipocytes (ACs), followed by extrusion-based 3D bioprinting. It was shown that the homogeneous distribution of lipid-filled ACs into an aqueous bioink solution was only possible by rapid cooling down to ice. Subsequent 3D bioprinting had no significant effect on cell viability, functionality, or adipogenic differentiation. The bioprinting process had no negative effects on cell death as the live-dead staining on day 1, day 8, or 15, respectively, demonstrated. Staining for intracellular lipids and perilipin A, as well as glycerol release as a marker of functionality, confirmed this. Compared with native tissue, differentiated ASCs (diffASC) also showed significantly fewer lipid-positive cells and released glycerol at day 15. Morphologically, ACs in GelMA also have more similarities to native tissue than diffASCs. Due to the limited long-term stability of GelMA, its origin, and crosslinking, biomaterials without animal origin were evaluated. The low-acetylated polysaccharide gellan gum (GG) proved to be a promising material. Stable and transparent hydrogels could be constructed by crosslinking with divalent ions in cell culture medium. The 1 % hydrogels were not cytotoxic or activated monocytes in indirect or direct assays. It was confirmed by lactate dehydrogenase (LDH) release, resazurin turnover, and live-dead staining. Acellular gels could be cultured for 98 days without significant changes and showed material properties suitable for adipose tissue. Because of this long-term stability, diffASCs could be cultured in GG for 98 days and mature into univacuolar adipocytes. This was demonstrated by staining intracellular lipids and perilipin A, as well as leptin secretion and glycerol release. Compared with native tissue, diffASCs had comparable, albeit smaller, morphology, similar proportions of lipid-positive and univacuolar cells. Based on GG, ACs were successfully encapsulated and assembled. Here, a GG concentration of 0.5% proved suitable, as homogeneously mixed hydrogels with high resazurin turnover and glycerol release were gained. For the additive setup of the GG-based models, optimization to bioink took place, enabled by the initial addition of divalent ions to increase viscosity and, thus, printability. The additively manufactured models showed no significant differences in viability or functionality. After 42 days in culture, univacuolar and functional cells were shown. By increasing the GG concentration to 1.5%, a successful 6D bioprinting procedure was established. Again, ASCs encapsulated in GG showed no viability, morphology, or differentiation differences after bioprinting. Finally, the adipogenesis of ASC-based models and adipocyte-specific phenotype were considered. No differences were found concerning viability. The adipogenic differentiation potential was most prominent in diffASC hydrogels. Both here and in the spheroids, stored lipids could be detected without medium induction. Consideration of the adipocyte-specific morphology of the matured models allowed the conclusion that the cells in the monolayers showed the most immature state in the form of multivacuolar, elongated diffASCs with actin stress fibers. The cells in the other models showed significantly larger lipid vacuoles with a roundish cytoskeleton. Quantitatively determined lipid, leptin, and glycerol levels suggest that the cells, except those in the monolayer, are in a steady state, supported by the relative gene expression of adipocyte-specific genes. In summary, in this work six different adipose tissue models were developed and evaluated and compared them with native tissue. Each analyzed model has individual strengths, resulting in different scopes of application and research questions. To achieve a in vivo-near model, diffASCs in GG hydrogels are a promising, long-term stable, mature adipose tissue model and can therefore be used as a flexible platform for in vitro testing