Antimikrobielle Aktivität der Histone bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

Abstract

The human intestine harbours a multitude of microorganisms. In addition to its func-tion as a protective layer against pathogens, it has to prevent an excessive immune answer against commensales simultaneously. Antimicrobial Peptides (AMPs) with their cationic character are playing an essential role in protection, because they are able to form voltage dependent channels on the surface of microorganism, which kill pathogens. In addition to the classical AMPs more antimicrobial active polypeptides, such as members of the histone family, were isolated. Histones are alkaline proteins, which are components of the chromatine. They are foremost responsible for packaging the DNA and for posttranslational modifications. Five different families can be differentiated: the core histones H2A, H2B, H3 and H4, as well as the linker histone H1. While extracellular histones show strong antimicrobial activity against a broad spectrum of microorganisms, the mechanism of their toxicity has not yet been sufficiently determined. If the antimicrobial protection layer of the intestine is weakened, due to a diminished expression of AMPs for instance, microorganisms can penetrate the mucosa and trigger inflammations. These findings have been confirmed in different tissues of patients with inflammatory bowel diseases (IBD), such as Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC). The aim of this work is to determine whether histones play a role in IBD. In the first part a systematic analysis of the transcriptome (Q-PCR) and the transla-tome (Western Blotting) of the core histones of colonic tissue was performed. In tis-sues of patients with CD gene expression data showed generally an increase of his-tones. In the cases of H2A and H2B the increase was significant. The quantification on the protein level offered an extreme variance of the expression of all core histones, irrespective of the analysed group. Significant differences were not detected. However, in trend H2B was lower in inflammation. After the systematic analysis, histones were then isolated of human colonic tissue. Before the extracted histones were fractionated via RP-HPLC and screened via MALDI-TOF-MS, different methods for the isolation of histones had been compared. The antimicrobial activity of the isolated histones of different intestinal tissues and mucus showed no differences between healthy controls and patients with IBD in flow cytometric tests. A significant increase of the histone activity in inflamed tissues of UC was only detected against S. aureus. The impact of the extracted histones seems to be strain-specific and higher against gram-positive species. As expected, extracel-lular histones could be detected in the mucus by immunehistological staining. Through ELISAs, protein concentrations of H2A and H2B were determined in the mucus and thus a slight increase of the histone proteins in UC was observed. In the last part of this work, the interactions of recombinant histones among them-selves and with other AMPs were analysed by flow cytometric viability assays. A strain-specific increase of the antimicrobial activity of histones among themselves and with AMPs was found. Thereby synergistic effects occurred frequently. The in-teractions of histones against several bacteria were visualised by electron microscope images and furthermore an agglutination of the microorganisms as well as a massive loss of cell integrity were detected. Variantions of the histones’ transcriptome and the translatome, as well as variations of the antimicrobial activity of histones in CED would have been evaluated as patho-logic defects. However, in this work such effects could not been confirmed. Because of their enormous antimicrobial activity histones still play an important role in the protection against microorganisms in the colon. Further studies have to show, if his-tones possess a therapeutic potential, and if they can be used as new antibiotics. This work was able to verify the strong potential of histones against different pathogens, which is absolutely comparable with the potential of classic AMPs, and could pro-mote inspiration for subsequent studies.

Der menschliche Darm beherbergt eine Vielzahl von Mikroorganismen. Neben seiner Funktion als Schutzschicht gegen Pathogene, muss er gleichzeitig eine exzessive Immunantwort gegen Kommensale verhindern. Eine entscheidende Rolle in der Verteidigung spielen antimikrobielle Peptide (AMPs), die aufgrund ihres kationischen Charakters spannungsabhängige Kanäle auf der Oberfläche von Mikroorganismen ausbilden und diese zerstören. Neben den „klassischen AMPs“ konnten weitere antimikrobiell aktive Polypeptide, wie z.B. Mitglieder der Histonfamilie isoliert werden. Histone sind basische Proteine, die als Bestandteil des Chromatins für die Verpackung der DNA verantwortlich und Ort posttranslationeller Modifikationen sind. Man unterscheidet fünf Familien, die Kernhistone H2A, H2B, H3 und H4 sowie das Linkerhiston H1. Extrazellulär zeigen Histone eine starke antimikrobielle Wirkung gegen ein breites Spektrum von Mikroorganismen, wobei der Mechanismus der Histontoxizität bisher wenig aufgeklärt ist. Wird die antimikrobielle Schutzschicht des Darms geschwächt, z.B. durch eine verminderte Expression antimikrobiell wirksamer Peptide, können Mikroorganismen in die Mukosa eindringen und zu Entzündungsreaktionen führen. Dieser Prozess konnte bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED), wie Morbus Crohn (MC) und Colitis ulcerosa (CU), in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden. Es war das Ziel der vorliegenden Arbeit die Rolle der Histone bei der Symptomausprägung der CED zu untersuchen. Im ersten Teil wurde eine systematische Analyse des Transkriptoms (Q-PCR) und Translatoms (Western Blots) der Kernhistone in Kolongeweben durchgeführt. Bei der Genexpression zeigte sich in entzündeten MC-Geweben eine tendenzielle Erhöhung der Histone, die bei H2A und H2B sogar signifikant ausfiel. Die Quantifizierung auf Proteinebene ergab eine extreme Streuung der Expressionsstärke bei allen Kernhistonen, unabhängig von der untersuchten Gruppe. Signifikante Unterschiede waren nicht zu erkennen. H2B war im Trend in der Entzündung erniedrigt. Nach der systematischen Analyse wurde im zweiten Teil der Fokus auf isolierte His-tone aus humanem Kolongewebe gelegt. Im Vorfeld wurden verschiedene Methoden zur Isolierung der Histone verglichen. Dazu wurden die extrahierten Histone durch Fraktionierungen per RP-HPLC und Massenanalyse mit MALDI-TOF-MS überprüft. Durchflusszytometrische Untersuchungen ergaben, dass die antimikrobielle Aktivität der isolierten Histone aus verschiedenen Darmgeweben und Mukus bei verschiedenen Mikroorganismen keine Unterschiede zwischen gesunden Kontrollen und CED-Patienten zeigten. Lediglich bei S. aureus ließ sich eine signifikant erhöhte Histonaktivität in entzündetem CU-Gewebe erkennen. Die Wirkung der extrahierten Histone scheint stammspezifisch zu sein und lässt eine höhere Aktivität gegen die getesteten grampositiven Spezies erkennen. Mit Hilfe immunhistologischer Färbungen konnten erwartungsgemäß extrazelluläre Histone im Mukus nachgewiesen werden. Mit Hilfe von ELISAs wurden im Mukus die Proteinkonzentrationen von H2A und H2B bestimmt und eine leichte Erhöhung der Histonproteine in CU-Gewebe beobachtet. Im letzten Teil der Arbeit wurden mittels durchflusszytometrischer Vitalitätstests die Wechselwirkungen zwischen rekombinanten Histonen, sowohl untereinander als auch mit anderen AMPs, untersucht. Dabei zeigte sich in allen Fällen eine stamm-spezifische Steigerung der antimikrobiellen Aktivität der Histone. Häufig traten sy-nergistische Effekte auf. Durch elektromikroskopische Aufnahmen konnte die Wir-kungsweise der Histone gegen verschiedene Bakterien visualisiert und eine Ver-klumpung der Bakterien sowie ein massiver Verlust der Zellintegrität beobachtet werden. Veränderungen des Transkriptoms und des Translatoms der Histone sowie der an-timikrobiellen Histonaktivität bei CED-Patienten hätten als pathologische Defekte der Erkrankungen gewertet werden können. Solche Effekte konnten in dieser Arbeit jedoch nicht bestätigt werden. Aufgrund ihrer enormen antimikrobiellen Aktivität spielen Histone aber trotzdem eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Mikroorga-nismen im Kolon. Ob Histone ein therapeutisches Potenzial besitzen und inwieweit sie als neue Antibiotika eingesetzt werden können, müssen weiterführende Studien zeigen. Diese Arbeit konnte das starke, mit klassischen AMPs durchaus vergleichba-re, Potenzial der Histone gegen die verschiedensten Erreger bestätigen und auf diese Weise Anregungen für nachfolgende Studien bringen.