Analysis of the structure of tomato mosaic virus movement protein based on virus host interactions

Abstract

Viruses are obligatory plant pathogens causing sever diseases, and ultimately great losses in crop yield. Plant viruses, once entered in the cell, make use of host machinery for its own replication and moves from one cell to the other. Natural resistance against virus attack is achieved by the presence of resistance genes (R genes). R genes recognize viral avirulence (Avr) factors in elicitor-receptor manner to initiate resistance cascade. In tomato, the resistance genes Tm-I, Tm-2 and Tm-22 are used to protect the plants against infection by tomato mosaic virus.Tm-2 and Tm-22 require recognition of the viral 30kDa movement protein (MP) for triggering resistance response. Sequence analysis of Tm-2 and Tm-22 resistance breaking viruses have shown an amino-acid exchange at position 133 (E>K) is found in all Tm-2 resistance breaking virus strains, whereas, amino-acid exchange at position 130 (K>E) is associated with Tm-22 resistance breaking phenotype (Calder and Palukaitis, 1992). This suggests a physical interaction between resistance genes and 30kDa MP. In the present study, a unique Split GFP approach is used to analyse the structure and localization of different domains of 30kDa MP in S. cerviceae and N. benthamiana. Different deletion mutants were fused between two non-overlapping halves of GFP and expressed. Results showed that both N and C terminus as well as the middle part of 30kDa MP (aa 80-150) is present in the cytoplasm with two integral membrane loops. These findings are in contrast with previous in-vitro results, which suggest that middle part of 30kDa MP is present in ER lumen, whereas N and C terminus in cytoplasm (Brill et al., 2000). Fluorescence microscopy revealed that GFP fused 30kDa MP deletion mutants were localized on the cytoplasmic side of plasmamembrane and near plasmodesmata. Membrane association of fusion protein confirmed the proper folding and functionality of deletion mutants. Therefore, the structural model of ToMV 30kDa MP has to be revised. Secondly, to identify the host factors involved in resistance mechanism, initiated by Tm-2 and Tm-22 resistance genes, tomato mosaic virus based vectors were constructed. Two different types of in-vivo transcription vectors were constructed, one containing both right and left border of the T-DNA (pBinSLN) and one without the right border (pBinSLN-RB). Self replication of these vectors were analysed in N. benthamiana, N. tabacum and S. lycopersicum. It was found that the deletion of RB does not affect virus replication, when agro-infiltrated in N. benthamiana. pBinSLN-RB was used further for the isolation of a stable and vigorous Tm-2 and Tm-22 resistance breaking ToMV strain through a novel selection scheme. ToMV2-22 contains two amino-acid exchanges at position 54(N>D) and 133(E>K). ToMV2-22 is the first mutant strain of ToMV, which can escape both Tm-2 and Tm-22 resistance simultaneously.

Viren sind obligate Parasiten und können bei Kulturpflanzen zu großen Ernteausfällen führen. Wenn Pflanzenviren in die Zelle eingedrungen sind, benutzen sie Wirtsproteine für ihre Replikation und wandern von Zelle zu Zelle. Natürliche Resistenz gegen Virusinfektionen in Pflanzen wird durch Resistenzgene (R-Gene) hervorgerufen. R-Gene erkennen virale Avirulenzfaktoren (Avr) in einer Elicitor-Rezeptorreaktion und lösen eine Abwehrkaskade aus. In Tomatenpflanzen benutzt man die Resistenzgene Tm-1, Tm-2 und Tm-22 zum Schutz gegen Tomatenmosaikvirus. Tm-2 und Tm-22 erfordern die Erkennung des viralen 30 kDa ?movement protein? (MP) für die Auslösung der Abwehrreaktion. Sequenzanalyse von Tm-2 und Tm-22 resistenzdurchbrechenden Viren zeigte entweder einen Aminosäureaustausch an Position 133 (E>K) bei allen Tm-2 durchbrechenden Viren während ein Aminosäureaustausch an Position 130 mit einem Tm-22 durchbrechenden Phänotyp assoziiert ist. Diese Befunde weisen auf eine direkte Interaktion zwischen diesen Resistenzgenen und dem 30 kDa MP hin. In der vorliegenden Arbeit wurde eine besondere Form des ?split GFP? Ansatzes verwendet um die Struktur und Lokalisation verschiedener Domänen des 30 kDa MP in S. cervisiae und N. benthamiana zu analysieren. Verschiedene Deletionen des MP wurden an zwei nicht überlappende Hälften des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) fusioniert und expremiert. Wenn sich diese Domänen im selben Zellkompartiment nahe beieinander befinden, können sich die GFP Teile zusammenlagern und ein fluoreszierendes Protein bilden. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, dass sich sowohl der N- als auch der C-Terminus und der mittlere Teil des MP (As 80-150) im Cytoplasma befinden und sich zwei integrale Membranbereiche vermuten lassen. Fluoreszenzmikroskopie zeigte eine Lokalisation der 30kDa MP GFP Fusionen an der cytoplasmatischen Seite der Zellmembran in der Nähe der Plasmodesmata. Alle Fusionsproteine waren membranassoziert, was auf eine korrekte Faltung hindeutet.

Diese Befunde stehen im Kontrast zu vorhergehenden in vitro Experimenten, die nahelegten, dass sich der mittlere Teil des 30 kDaMP im ER Lumen befindet, während N- und C-Terminus im Cytoplasma sind. Deshalb muß das bisherige Strukturmodel des ToMV 30kDa MP revidiert werden. Um Wirtsfaktoren zu identifizieren, die in den Resistenzmechanismen involviert sind, welche von den Resistenzgenen Tm-2 und Tm-22 ausgelöst werden, wurden Vektoren auf der Basis des ToMV entwickelt. Zwei unterschiedliche Typen von ?in vivo? Transkriptionsvektoren zur Agroinfektion wurden konstruiert. Ein Typus enthält sowohl die rechte als auch die linke ?T-border? Sequenz der T-DNA (pBinSLN) während der andere ohne die rechte ?T-border Sequenz konstruiert wurde (pBinSLN-RB). Die Replikation dieser Vektoren wurde in N. benthamiana, N. tabacum und S. lycopersicum analysiert. Es zeigte sich, das eine Deletion der rechten ?T-border? keinen Einfluß auf die Virusvermehrung nach Agroinfiltration von N. benthamiana hatte. pBinSLN-RB wurde verwendet um mit einem neuartigen Selektionssystem eine stabile und schnell wachsende ToMV Mutante isoliert, die sowohl die Tm-2 als auch die Tm-22 Resistenz durchbrechen kann (ToMV2-22). ToMV2-22 besitzt zwei Aminosäureaustausche im 30 kDa MP an Position 54 (N>D) und 133 (E>K). ToMV2-22 ist die erste Mutante von ToMV, die beide Resistenzgene Tm-2 und Tm-22 gleichzeitig überwinden kann.