Intrazelluläres Trafficking des intestinalen Anionenaustauschers Down-Regulated in Adenoma (DRA;SLC26A3)

Abstract

Electroneutral NaCl absorption occurs from the small intestine to the distal colon. This ion exchange is preferentially mediated by DRA and NHE3. Knockout mice, which suffer from chronic diarrhea, as well as the human genetic disorder congenital chloride diarrhea, in which a nonfunctional DRA leads to life-threatening diarrhea emphasize the importance of these two transporters. To elucidate this defective NaCl absorption it is necessary to understand the physiological regulation of these two transport proteins within enterocytes as well as the responsible extra- and intracellular signal transduction pathways. Both transport proteins interact with PDZ adaptor proteins of the NHERF family. Furthermore, both exchangers are partially localized within lipid rafts. The situation for NHE3 is complex in that its lipid raft localization is not only necessary for its normal activity but also for its basal and stimulated trafficking. Lipid rafts are involved in PI3-kinase dependent exocytosis of NHE3. Since the function of NHE3 and DRA appears to be regulated in parallel the function of DRA maybe depends on its rafts association as well. Thus the first objective of this thesis was to investigate whether the lipid raft association of DRA is essential for the surface expression and transport activity of DRA and also to analyze whether DRA is inserted into the plasma membrane in a PI3-kinase and lipid raft dependent manner. The present data show that: (A) Disruption of lipid raft integrity leads to functional inhibition and decreased cell surface expression of DRA. In HEK cells the inhibition of DRA activity as well as the decreased cell surface expression are entirely dependent on the presence of the PDZ interaction motif of DRA. In Caco-2/BBE cells on the other hand only part of the inhibition of DRA activity by disruption of raft integrity depends on the ability of DRA to interact with PDZ adaptor proteins. (B) Basal activity as well as basal surface expression of DRA depend on PI3-kinase activity in a way that requires the ability of DRA to interact with PDZ adaptor proteins. (C) Lipid rafts and PI3-kinase are situated along the same pathway, where DRA is present in lipid rafts before it is inserted into the plasma membrane. However, the inhibition of PI3-kinase has no influence on the raft association of DRA. Furthermore, the disruption of raft integrity does not inhibit the PI3-kinase activity. Based on these findings a model can be established as follows: DRA is present in lipid rafts in an intracellular fraction. Insertion into the plasma membrane from this intracellular compartment requires the interaction with one (or several) PDZ adaptor proteins, raft integrity and the action of PI3-kinase. To characterize the interplay between PI3-kinase, raft association and PDZ interaction of DRA with its insertion into the plasma membrane the recycling pathway of DRA was then investigated. The generated data show that the proteolytic degradation of DRA-ETKFminus occurs faster than the degradation of wild type DRA. Endosomal distribution of DRA depends on its PDZ-binding motif. The sorting process from early to recycling endosomes depends on the interaction of DRA with one or several PDZ adaptor proteins. Expression of dominant negative Rab11a leads to a decreased surface expression and transport activity of DRA. In conclusion, it was shown in this thesis that an intense interplay between PDZ interaction, lipid raft association, PI3-kinase and the activity and surface expression of DRA exists. It was also shown that the endosomal distribution of DRA depends on its PDZ-binding motif. Finally, it was demonstrated that DRA is recycled to the plasma membrane by Rab11a-enriched recycling endosomes.

Die elektroneutrale NaCl-Resorption im Intestinaltrakt erfolgt durch parallelen Natrium/Protonen- und Chlorid/Hydrogencarbonat-Austausch vermittelt durch die Transportproteine NHE3 und DRA. Knockout-Mäuse, die an chronischer Diarrhöe leiden, sowie die Kongenitale Chlorid Diarrhöe, bei der ein nicht funktionelles DRA eine lebenslange Diarrhöe hervorruft, heben die Wichtigkeit dieser beiden Transportproteine hervor. Um diese fehlerhafte NaCl-Resorption aufzuklären, müssen die physiologische Regulation beider Transportproteine sowie die verantwortlichen extra- und intrazellulären Signaltransduktionswege aufgedeckt werden. Beide Transportproteine interagieren mit PDZ-Adapterproteinen der NHERF-Familie. Beide Ionenaustauscher sind partiell in Rafts lokalisiert. Eine Störung der Raft-Integrität hat eine verminderte Transportaktivität von NHE3 zur Folge. Des Weiteren ist der Einbau von NHE3 in die Plasmamembran abhängig von dessen partieller Raft-Assoziation und der PI3-Kinase. Auf Grund der funktionellen Kopplung von NHE3 und DRA können die Erkenntnisse zur Raft-Assoziation und zum Einfluss der PI3-Kinase auf die Exozytose von NHE3 als Paradigma für DRA gelten. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde daher untersucht, welche Rolle die partielle Raft-Assoziation von DRA für dessen Plasmamembranexpression und Transportaktivität spielt sowie welchen Einfluss die PI3-Kinase hat. Es konnte Folgendes gezeigt werden: (A) Eine Störung der Raft-Integrität führt zu eine Reduktion des durch DRA vermittelten Chlorid/Hydrogencarbonat-Austausches. In HEK-Zellen war die Inhibition der Transportaktivität abhängig von dem Vorhandensein des PDZ-Interaktionsmotivs. In Caco-2/BBE-Zellen war hingegen die Inhibition des durch DRA vermittelten Chlorid/Hydrogencarbonat-Austausches nur teilweise abhängig von der PDZ-Interaktion. (B) Eine Störung der Raft-Integrität hat eine Reduktion der Oberflächenexpression von DRA zur Folge, nicht jedoch von DRA-ETKFminus, einer Mutante, der das PDZ-Interaktionsmotiv fehlt. (C) Die basale Transportaktivität sowie Oberflächenexpression von DRA wird gesteuert von der PI3-Kinase in Abhängigkeit vom PDZ-Interaktionsmotiv. (D) Lipid Rafts und die PI3-Kinase beeinflussen denselben Trafficking-Pfad von DRA, wobei eine Inhibition der PI3-Kinase keinen Einfluss auf die Raft-Assoziation von DRA hat und eine Störung der Raft-Integrität die Kinaseaktivität der PI3-Kinase hingegen nicht hemmt. Diese Ergebnissen deuten darauf hin, dass die Insertion von DRA in die Plasmamembran intakte Lipid Rafts, eine aktive PI3-Kinase sowie die Interaktion mit einem oder mehreren PDZ-Adapterproteinen erfordert. Um das Zusammenspiel von Lipid Rafts, PI3-Kinase und PDZ-Adapterproteinen in Bezug auf die Exozytose von DRA besser charakterisieren zu können, wurde der Recycling-Weg von DRA ? vom frühen Endosom zum recycling Endosom bzw. späten Endosom ? untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der lysosomale Abbau von DRA-ETKFminus schneller als der lysosomale Abbau von DRA erfolgt, obwohl DRA und DRA-ETKFminus zu gleichen Anteilen an der Plasmamembran exprimiert werden. Auch wurde gefunden, dass die endosomale Verteilung von DRA abhängig von dessen PDZ-Interaktionsmotiv ist. In recycling Endosomen findet sich hauptsächlich Wildtyp-DRA, aber kein DRA-ETKFminus. Dieses findet sich dafür zu größeren Anteilen in späten Endosomen (C) Darüberhinaus zeigte sich, dass dominant negatives Rab11a (Rab11aS25N) eine Reduktion der Transportaktivität und Oberflächenexpression von DRA zur Folge hat. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit somit gezeigt werden, dass ein enges Zusammenspiel zwischen PDZ-Interaktion, Lipid Raft-Assoziation, PI3-Kinase und der Transportaktivität sowie Plasmamembranexpression von DRA besteht. Die endosomale Verteilung von DRA ist abhängig von dessen PDZ-Interaktionsmotiv und DRA gelangt über Rab11a-haltige recycling Endosomen zur Plasmamembran.