Die Bedeutung von Aquaporinen und ihren Interaktionspartnern für die Zelltodregulation in Pflanzen

Abstract

Programmed cell death (PCD, apoptosis) is an induced cell suicide process that plays an important role during the differentiation and pathogen defense responses of plants and animals. BHRF1 (?BamHI fragment H rightward open reading frame no. 1?) is a cell-death modulating protein of the Epstein-Barr virus (EBV), a human lymphotrophic herpes virus. The expression of BHRF1 in transgenic plants led to the formation of necrotic lesions. Further experiments showed that BHRF1 associated necrotic lesions are caused due to stress, senescence and pathogen defense responses. Yeast-two-hybrid-screening of a tobacco cDNA library identified two different aquaporins as partners for interacting with BHRF1. Aquaporins were identified as water channels/carriers within red blood cells, but are also present in all other organisms. Over the last years, more information was gathered indicating that, apart from transporting water, aquaporins had other functional activities. E. g. Henzler and Steudle (2000) demonstrated that aquaporins can act as hydrogen peroxide channels in the algae Chara corallina. Furthermore, publications by Bienert et al. (2006), indicating that aquaporins in plants as well as in animals are also able to transport H2O2. Hydrogen peroxide and other reactive oxygen species (ROS) have long been recognized as important signal molecules during the pathogen defense response in plants, therefore establishing a logical connection between cell death and aquaporins for the first time. It was assumed that the aquaporins NtPIP2.2a, NtPIP2.2b und NtTIP1.1a identified during the yeast-two-hybrid-screen can act as H2O2 channels. In further experiments it could indeed be established that these aquaporins have the ability to transport H2O2 in yeast cells. Yeasts expressing aquaporins could be influenced in their H2O2 sensitivity by the expression of BHRF1. BHRF1 without transmembrane domain (BHRF1deltaTMwt) led to an enhanced H2O2 sensitivity and also to an increase in cell death. In addition, the transient expression of aquaporin could induce necrotic lesions and cell death in Nicotiana benthamiana. Deletion experiments identified a common binding domain for interacting with BHRF1 in these aquaporins. This binding domain consists of the conserved region containing the first NPA motive (?loop? B) that is also half of one pore. Further studies showed that BHRF1 interacts with all kinds of different aquaporins from plants, animals (rAQP8) and humans (hAQP1). BHRF1 most likely binds with the alpha3 helix to the highly conserved NPA region of aquaporins. A cellular protein showing sequence homology to M20 proteases and aminoacylases was isolated when looking for interaction partners of aquaporins in plants. Like BHRF1, this protein binds to the conserved NPA region of the aquaporins. Although the cellular substrate for this protein has to be found yet, an interesting observation was made. Co-expression of the isolated aminoacylase with NtTIP1.1a or NtPIP2.2b in Nicotiana benthamiana led to the inhibition of cell death induced by these aquaporins.

Programmierter Zelltod (PCD, Apoptose) ist ein induziertes Selbstmordprogramm von Gewebezellen, das bei der Differenzierung und der Pathogenabwehr bei Pflanzen und Tieren von großer Bedeutung ist. BHRF1 (?BamHI fragment H rightward open reading frame no. 1?) ist ein Zelltod modulierendes Protein des Epstein-Barr Virus (EBV), einem humanen lymphotrophen Herpesvirus. Die Expression von BHRF1 in transgenen Pflanzen führte zur Bildung von Nekrosen. Weitere Experimente zeigten, dass BHRF1 assoziierte Nekrosen durch Stress, Seneszenz und Pathogenabwehr induziert werden. Die Durchsuchung einer Tabak cDNA-Bank mit dem Hefezweihybridsystem brachte zwei unterschiedliche Aquaporine als Interaktionspartner für BHRF1 hervor. Aquaporine wurden als Wasserkanäle in roten Blutkörperchen identifiziert, wurden aber auch in allen anderen Organismen gefunden. In den letzten Jahren traten vermehrt Hinweise auf, die zusätzlich zum Wassertransport der Aquaporine weitere Aktivitäten zuließen. Henzler und Steudle (2000) zeigten z. B. dass in der Alge Chara corallina Aquaporine als H2O2-Kanäle fungieren können. Weiterhin gab es Veröffentlichungen von Bienert und seinen Mitarbeitern (2006) wonach auch pflanzliche und tierische Aquaporine zum H2O2-Transport fähig sind. Da H2O2 und andere reaktive Sauerstoffspezies (ROS) schon lange als wichtige Signalsubstanzen im Rahmen der Pathogenabwehr in Pflanzen gelten, entstand dadurch zum ersten Mal eine logische Verknüpfung zwischen Zelltod und Aquaporinen. Deshalb war zu vermuten, dass es sich bei den im Hefezweihybridscreen identifizierten Aquaporine NtPIP2.2a, NtPIP2.2b und NtTIP1.1a um solche H2O2-Kanäle handelt. Es stellte sich heraus, dass diese Aquaporine in der Tat in Hefen als H2O2-Kanäle fungieren. Dabei konnte die H2O2-Sensitivität Aquaporin exprimierender Hefen durch die zusätzliche Expression von BHRF1 beeinflusst werden. BHRF1 ohne Transmembrandomäne (BHRF1deltaTMwt) führte zu einer erhöhten Sensitivität gegenüber H2O2 und somit zu verstärktem Zelltod. Auch in Nicotiana benthamiana konnte durch eine transiente Expression von Aquaporinen Nekrosen und somit Zelltod induziert werden. Durch gezielte Deletionen der Aquaporine konnte eine gemeinsame Bindedomäne für die Interaktion mit BHRF1 identifiziert werden. Diese besteht aus der konservierten Region, welche das 1. NPA-Motiv (?loop? B) enthält und die eine Hälfte der Pore bildet. Weitere Interaktionsstudien zeigten, dass BHRF1 mit den verschiedensten Aquaporinen, darunter das humane Aquaporin 1 (hAQP1) sowie Aquaporin 8 aus der Ratte (rAQP8) interagiert. BHRF1 bindet hierbei wahrscheinlich mit der alpha3-Helix an die konservierte NPA-Region der Aquaporine. Auf der Suche nach pflanzlichen Interaktionspartnern von Aquaporinen wurde ein zelluläres Protein mit Homologie zu M20-Proteasen und Aminoacylasen isoliert. Auch dieses Protein bindet wie BHRF1 an die konservierte NPA-Domäne der Aquaporine. Während das zelluläre Substrat für dieses Protein noch nicht gefunden werden konnte, wurde in Nicotiana benthamiana eine interessante Entdeckung gemacht. Eine Ko-Expression der isolierten Aminoacylase mit NtTIP1.1a bzw. NtPIP2.2b führte zur Inhibierung des durch die Aquaporine induzierten Zelltods in Nicotiana benthamiana.