Untersuchungen zur autonomen und YidC-vermittelten Membraninsertion von Pf3 coat-Protein mit Hilfe Fluoreszenz-spektroskopischer Einzelmolekülmessungen

Abstract

Pf3 coat is the capsid protein of the bacteriophage Pf3. The phage leaves the host cell by continuous extrusion without damaging the cell. The protein itself consists of 44 amino acid residues and has a rod-like shape. Because of its simple structure, the protein needs only the help of the insertase YidC to insert into the bacterial inner membrane. 3L-Pf3 coat, a protein mutant with three additional leucine residues in the center of the transmembrane region (TMD), has an increased hydrophobicity. It is independent of YidC and inserts into the membrane autonomously (Serek et al., 2004). In this work, a newly developed physical method was used to find out whether the elongation or the increased hydrophobicity accounts for the autonomous insertion of the protein. For this reason, two new protein mutants were constructed. Each mutant has only one of the changed properties of the 3L-Pf3 coat protein: GAT-Pf3 coat has an elongated TMD with three additional residues (glycine, alanin and threonine). The second mutant, 2M-Pf3 coat, shows an increased hydrophobicity due to the substitution of two alanine residues by two methionine residues at the positions 30 and 31. So it had an increased hydrophobicity like 3L-Pf3 coat. The above mentioned proteins, wt-Pf3 coat and its mutants, were modified with a fluorescent label to follow the proteins with optical methods. The Proteins were first modified with a single cysteine and then labeled by a fluorescent marker, Atto520 maleimid. Proteins with a labeled N-terminal tail were called NC-Pf3 coat, whereas CC-Pf3 coat had a labeled C-terminal tail. In addition, the orientation of the protein in the membrane was identified by quenching the fluorescence of the NC- and CC- labeled proteins. A new method employing single molecules was developed using fluorescence correlation spectroscopy. This method allows real time observations of binding and insertion of the protein into semisynthetical liposomes. By using fluorescent quenching the membrane insertion and binding were distinguished. It became clear that both the elongation of the TMD as well as an increased hydrophobicity play a crucial role in the autonomous insertion of the protein into the membrane. Therefore, the interaction between the hydrophobic region of the protein and the hydrophobic core region of the membrane is important for the binding of the protein and its insertion into the membrane.

Das Haupthüllprotein des Bakteriophagen Pf3, Pf3 coat, ist ein 44 Aminosäuren großes, alpha-helikales, stäbchenförmiges Protein. Auf Grund seiner geringen Größe und der einfachen Struktur wird es nach der Synthese im Cytoplasma mit Hilfe der Insertase YidC in die Membran eingebaut. Dort setzen sich die Pf3 coat-Proteine zur Phagenhülle zusammen. Die Proteinvariante 3L-Pf3 coat besitzt einen verlängerten, transmembranen Bereich durch die Einführung von drei zusätzlichen Leucinen zwischen den Aminosäuren Ile26 und Ile27. Zusätzlich ist die Hydrophobizität dieser Domäne erhöht. Das Protein ist in der Lage, sich unabhängig von YidC in eine Membran einzubauen (Serek et al., 2004). In dieser Arbeit wurde mit Hilfe einer neu entwickelten physikalischen Messmethode anhand weiterer Proteinvarianten untersucht, ob die Verlängerung der transmembranen Domäne (TMD), oder aber die Erhöhung der Hydrophobizität für den autonomen Membraneinbau die zentrale Rolle spielt. Dafür wurden zwei Proteinvarianten konzipiert, die jeweils eine der veränderten Eigenschaften des 3L-Pf3 coat-Proteins tragen. Das verlängerte Protein GAT-Pf3 coat trägt bei gleichbleibender Hydrophobizität drei zusätzliche Aminosäuren (Glycin, Alanin und Threonin) in der TMD. Die zweite Proteinvariante, 2M-Pf3 coat, besitzt durch den Austausch der Aminosäuren Ala30 und Ala31 gegen zwei Methionine bei unveränderter Länge der TMD eine erhöhte Hydrophobizität. Für den Einsatz optisch-physikalischer Messmethoden wurden die Proteine mit einem Fluoreszenz-farbstoff verbunden. Dafür wurde ein Cysteinrest des Proteins über eine Maleimid-Verbindung mit dem Fluoreszenzfarbstoff Atto520-maleimid markiert. Pf3 coat-Protein selbst enthält keine Cysteinreste. Daher erhielten die NC-Varianten, und auch das wildtypische Pf3 coat-Protein, einen Aminosäureaustausch an Position 3 (NC-Pf3 coat). Dort wurde ein Serin gegen ein Cystein ausgetauscht. Im Falle von wt-Pf3 coat und 3L-Pf3 coat wurden außerdem CC-Varianten hergestellt. Hier wurde das C-terminale Phenylalanin gegen ein Cystein ausgetauscht. So konnte zusätzlich zum Einbau die Orientierung des Proteins in der Membran bestimmt werden. Mit Hilfe der markierten Proteine wurde die Methode der optisch-physikalischen Einzelmolekül-messung entwickelt, mit deren Hilfe man den Einbau des Proteins in DOPC-Liposomen in Echtzeit verfolgen konnte. Durch die Nutzung der Fluoreszenzlöschung konnte dabei zwischen der Bindung an die Membran und dem Einbau unterschieden werden. Es wurde festgestellt, dass sowohl eine Verlängerung der TMD als auch eine gesteigerte Hydrophobizität einen autonomen Einbau in die Membran bewirken können.