Rolle von SNARE-Proteinen bei der Mediatorfreisetzung humaner Mastzellen

Abstract

Mast cells are involved in a variety of physiological and pathophysiological processes in the body. They posses a wide range of stored and de novo synthesized inflammatory mediators. Therefore they play an important role not only in allergic diseases - as it was originally assumed. The aim of the present work is to acquire a more detailed insight into the processes of mediator release of human intestinal tissue mast cells. To enable the release of histamine, proteases, cytokines, chemokines and other substances, it is necessary that secretory vesicles fuse with the plasma membrane. In this process so-called SNARE proteins are essentially involved. They are generally divided into vesicle membrane (v) - and target membrane (t) -SNAREs. The present work could show that a large number of SNAREs are expressed in human intestinal mast cells. The t-SNAREs SNAP-23, syntaxin-2, -3, -4, -6, Vti1b, and the v SNAREs VAMP-2, -3, -5, -7, -8 could be clearly detected, while SNAP-25, Syntaxin-1b and VAMP-4 were expressed only slightly. A subsequent visualization of these proteins by coupling with fluorescence-marked antibodies showed their localization in the cell. There is a clear arrangement of the t-SNAREs SNAP-23, syntaxin-3, -4 and -6 at the plasma membrane, whereas syntaxin-2, Vti1b, VAMP-3, -7 and -8 are distributed in the cytoplasm in resting cells. However, after activation of the cells for 15 minutes, this arrangement changed for VAMP-7 and -8 which moved in the direction of the plasma membrane, as well as Vti1b, which shifted after a prolonged activation phase of 2 hours also towards the cell edge. In activated mast cells colocalization of SNAP-23, syntaxin-3 and -4, VAMP-7 and -8, as well as Vti1b could be demonstrated. Using co-immunoprecipitation complex formation of SNAP-23 with syntaxin-4, VAMP-7 and -8 was confirmed. For the elucidation of the functional significance of individual SNARE proteins, respective SNAREs have been turned off. After transfection of human intestinal mast cells by using different transfection reagents failed, transfection of mast cells with siRNA by electroporation succeeded. However, it turned out that the electrically treated cells lost their ability to be stimulated. In contrast, blocking of the SNARE proteins achieved by using inhibitory antibodies was successful with no deterioration of cells. Interestingly enough it was revealed that a variety of SNARE proteins participate in degranulation processes in mast cells. The release of the prestored beta-hexosaminidase was significantly reduced by antibodies against SNAP-23, syntaxin-3, -4 and -6, VAMP-7 and -8 and Vti1b after a stimulation time of one hour. It could be noted that VAMP-7 seemed to play no role anymore in the case of a prolonged activation time of six hours. The same SNAREs were also responsible for the release of LTC4. The liberation of the cytokines and chemokines IL-5, IL-6, IL-8, MCP-1, MIP-1-alpha and MIP-1-beta showed an inconsistent involvement of SNARE proteins. However, inhibition of SNAP-23, syntaxin-3 and Vti1b resulted in almost complete blockage of the release of all measured cytokines. Furthermore, antibodies against syntaxin-6 caused a significant reduction in the secretion of IL-5, IL-8 and MCP-1 and a trend towards a reduction of IL 6, MIP-1-alpha and MIP-1-beta. To different degrees both of the v-SNAREs VAMP-7 and -8 seemed to account individually for the release of different cytokines. Since release of the chemokine MIP-1-beta was not affected neither by the blockade of VAMP-7 nor by VAMP-8, another non-studied member of the VAMP family could be involved. Inhibition of syntaxin-4 led only for IL-8 to a marked and significant reduction in the release. In summary, it was shown that the release of different mediators in human intestinal mast cells is catalyzed by various different SNAREs and thus the existence of specific carriers and a targeted transport of mediators are very likely. One explanation for the involvement of a number of SNARE proteins in secretion processes may be that while some SNAREs are responsible for building up intracellular structures which are necessary for the compound exocytosis, some others are in charge of the docking of vesicles at the plasma membrane. A detailed understanding of the mechanisms and the involvement of specific SNARE proteins in the release of various mediators of human mast cells is the basis for new forms of treatments for allergies and asthma. New therapeutic approaches might aim through the temporary deactivation of certain SNARE proteins to achieve an intended reduction of mediator release.

Mastzellen sind an einer Vielzahl physiologischer und pathophysiologischer Vorgänge im Körper beteiligt. Sie verfügen über ein breites Spektrum an gespeicherten sowie de novo synthetisierten inflammatorisch wirksamen Mediatoren, weshalb sie nicht nur - wie ursprünglich angenommen - bei allergischen Erkrankungen eine wichtige Rolle spielen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, einen detaillierten Einblick in die Prozesse der Mediatorfreisetzung reifer menschlicher Mastzellen zu vermitteln. Damit es zur Ausschüttung von Histamin, Proteasen, Zytokinen, Chemokinen und anderen Mediatoren kommen kann, müssen sekretorische Vesikel mit der Plasmamembran fusionieren. An diesem Vorgang sind sogenannte SNARE-Proteine essenziell beteiligt. Diese werden allgemein in Vesikel¬membran (v) - und Ziel (target) membran (t) - SNAREs eingeteilt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine ganze Reihe von SNAREs in humanen Darmmastzellen exprimiert werden. Die t-SNAREs SNAP-23, Syntaxin-2, -3, -4, -6 und Vti1b sowie die v-SNAREs VAMP-2, -3, -5, -7, - 8 konnten klar nachgewiesen werden, während SNAP-25, Syntaxin-1b und VAMP-4 nur schwach exprimiert vorliegen. Durch eine anschließende Markierung dieser Proteine mit fluoreszenzgekoppelten Antikörpern konnte deren Lokalisation in der Zelle mikroskopisch dargestellt werden. Es zeigte sich eine deutlich plasmamembranständige Anordnung der t-SNAREs SNAP-23, Syntaxin-3, -4 und -6, während Syntaxin-2, Vti1b, VAMP-3, -7 und -8 in ruhenden Zellen zytoplasmatisch verteilt sind. Nach Aktivierung der Zellen änderte sich diese Anordnung jedoch für VAMP-7 und -8, die nach 15-minütiger Stimulation in Richtung Plasmamembran wanderten sowie Vti1b, das sich nach einer längeren Aktivierungsphase von 2 Stunden ebenfalls an den Zellrand verlagerte. In aktivierten Mastzellen gelang es außerdem, Kolokalisationen von SNAP-23, Syntaxin-3 und -4, VAMP-7 und -8 sowie Vti1b sichtbar zu machen. Mittels Ko-Immunpräzipitation wurden Komplexbildungen von SNAP-23 mit Syntaxin-4, VAMP-7 und -8 bestätigt. Für die Aufklärung der funktionellen Bedeutung der jeweiligen SNARE-Proteine wurden einzelne SNAREs inhibiert. Hierzu wurden inhibitorische Antikörper in die Zelle eingebracht. Interessanterweise zeigte sich bei einer ganzen Reihe von SNARE-Proteinen eine Beteiligung an Ausschüttungs¬prozessen in Mastzellen. Die Freisetzung der gespeichert vorliegenden Beta-Hexosaminidase wurde durch Antikörper gegen SNAP-23, Syntaxin-3, -4 und -6, VAMP-7 und -8 sowie Vti1b nach einer Stimulationszeit von einer Stunde deutlich reduziert. Erstaunlicherweise schien im Gegensatz dazu VAMP-7 im Falle einer längeren Aktivierungszeit der Zellen von sechs Stunden keine Rolle mehr zu spielen. Die gleichen SNAREs waren außerdem auch für die Freisetzung von LTC4 verantwortlich. Für die Ausschüttung der gemessenen Zytokine und Chemokine IL-5, IL-6, IL-8, MCP-1, MIP-1-alpha und MIP-1-beta zeigte sich eine uneinheitliche Beteiligung von SNARE-Proteinen. Allerdings ergab sich durch die Inhibition von SNAP-23, Syntaxin-3 und Vti1b für alle gemessenen Zytokine eine fast vollständige Blockade der Freisetzung. Des Weiteren verursachten Antikörper gegen Syntaxin-6 eine signifikante Reduktion der Ausschüttung von IL-5, IL-8 und MCP-1 sowie eine tendenzielle Verminderung von IL 6, MIP-1-alpha und MIP-1-beta. Von den v-SNAREs VAMP-7 und -8 schien zum Teil das eine, zum Teil das andere für die Ausschüttung der verschiedenen Zytokine notwendig zu sein. Da für das Chemokin MIP-1-beta weder die Blockade von VAMP-7 noch VAMP-8 einen Effekt hervorriefen, könnte auch noch ein weiteres, nicht untersuchtes Mitglied der VAMP-Familie beteiligt sein. Die Inhibition von Syntaxin-4 führte nur für IL-8 zu einer deutlichen und signifikanten Reduktion der Freisetzung. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die Freisetzung verschiedener Mediatoren in humanen Darmmastzellen durch unterschiedliche SNAREs katalysiert wird und somit die Existenz spezifischer sekretorischer Vesikel und ein gezielter Transport von Mediatoren sehr wahrscheinlich sind. Eine Erklärung für die Beteiligung einer ganzen Reihe von SNARE-Proteinen an Ausschüttungsprozessen könnte sein, dass für das Ausbilden intrazellulärer Strukturen, die für die compound exocytosis notwendig sind, andere SNAREs verantwortlich sind, als für das Andocken von Vesikeln an der Plasmamembran. Ein detailliertes Verständnis der Mechanismen und der Beteiligung spezifischer SNARE-Proteine an der Freisetzung verschiedener Mediatoren menschlicher Mastzellen könnte eine Grundlage für neuartige Behandlungsformen von Allergien und Asthma bilden. Neue Therapieansätze könnten darauf abzielen, durch das zeitweilige Ausschalten bestimmter SNARE-Proteine eine gezielte Reduktion der Mediatorenfreisetzung zu erreichen.