Tocotrienols, tocopherols and tocomonoenols : characterization in Costa Rican palm oils, and intracellular and tissue distribution as a function of the hepatic alpha-tocopherol transfer protein

Abstract

Vitamin E is a generic term for a group of micronutrients exhibiting the biological activity of alpha-tocopherol. Initially, four tocopherols (T) and four tocotrienols (T3) were recognized as the naturally occurring vitamin E compounds. The main difference among T and T3 is the 3-fold unsaturated 16-carbon side chain of the T3 compared to the saturated 16-carbon side chain of the T. Recently, a group of four vitamin E compounds with a single double bond at carbon 11 were discovered, namely tocomonoenols (T1). Edible oils are the major source of T, T3, and of T1. As a fat-soluble vitamin, the vitamin E is absorbed after oral intake and transported in the circulation to the liver, where vitamin E undergoes sorting by the action of the alpha-hepatic-tocopherol transfer protein (TTP) and the cytochrome P450 (CYP) enzymes. alpha-T is preferentially secreted into the bloodstream, while the non-alpha-T congeners are metabolized by CYP to the carboxyethylhydroxychromanols (CEHC), which are excreted via urine and feces. The TTP has been recognized as necessary for the maintenance of normal alpha-T concentrations in plasma and extrahepatic tissues. Interestingly, TTP might also protect the non-alpha-T congeners from side-chain degradation, and therefore prevent their metabolic degradation. The present thesis aimed at increasing our knowledge of the non-αT congeners of vitamin E with respect to their occurrence in food, their intracellular localization upon uptake into liver cells, and their tissue distribution in mammals. A potential role of the TTP in the intracellular and intra-organismic trafficking of the non-alpha-T congeners was a second focus of the current investigations. To this purpose, the vitamin E profiles and contents in oils of three Elaeis Guineensis, two Elaeis Oleifera, and one hybrid OxG palm fruit genotypes from Costa Rica were determined after mechanical extraction with a screw press and chemical extraction with hexane. Vitamin E profiles in the palm oils were similar, irrespective of the genotype and extraction procedure, and alpha- and gamma-T3 were the most abundant congeners. alpha-T1 was found in oils from five of the six varieties. Hexane extraction yielded up to 2.5-fold higher total vitamin E compared to screw press extraction. The two most abundant tocotrienols in the oils were selected for further studies with respect to their cellular uptake and intracellular distribution in cultured liver cells with and without stable expression of TTP and compared to their respective tocopherol counterparts. After uptake, all four congeners were primarily associated with the lysosomes, endoplasmic reticulum and plasma membrane. Overall, the results conclude that neither the structural differences between the four congeners, nor the TTP-expression are important factors behind the intracellular trafficking (uptake and distribution) of the congeners in cultured liver cells. Finally, an animal study was performed to examine the tissue distribution of alpha-T1 in mice in comparison to alpha-T. Besides was investigated the influence of TTP. Wild-type and TTP knockout mice were fed a standard diet with either alpha-T or alpha-T1 for 2 weeks. Concentrations were measured in blood and several tissues. alpha-T1 was only found in blood, not in tissues. Loss of TTP function in knockout mice resulted in almost complete depletion of alpha-T in all tissues. Interestingly, alpha-T1 was still present in blood. In conclusion, alpha-T1 reached the blood in mice with and without TTP function, suggesting that TTP may not, or only to a limited extent, be required for the secretion of alpha-T1 into the systemic circulation. Since more is known about alpha-T than the non-alpha-T congeners, new opportunities for further research on the biological activities and consequent health benefits of the non-alpha-T congeners have arisen based on the contributions of the present thesis.

Vitamin E ist der Oberbegriff für eine Gruppe von Mikronährstoffen, welche die biologische Aktivität von alpha-Tocopherol aufweisen. Bisher wurden acht Kongenere, vier Tocopherole (T) und vier Tocotrienole (T3) als die natürlich vorkommenden Vitamin-E-Verbindungen klassifiziert. Die Unterscheidung zwischen T und T3 wird durch die dreifach ungesättigte 16-Kohlenstoff lange Seitenkette der T3´s im Vergleich zur gesättigten 16- Kohlenstoff langen Seitenkette der T´s definiert. Vor kurzem wurde eine Gruppe von vier Vitamin-E-Verbindungen mit einer Einfach-Doppelbindung am 11ten Kohlenstoffatom entdeckt und als Tocomonoenole (T1) bezeichnet. Speiseöle sind die Hauptquelle für T, T3 und T1. Das fettlösliches Vitamin E wird oral aufgenommen und zur Leber transportiert. In der Leber durchlaufen die Vitamin E Kongenere eine Sortierung durch das alpha-hepatischen-Tocopherol-Transferprotein (TTP) und der Cytochrom P450 (CYP)-Enzyme. Das alphaT wird bevorzugt in den Blutkreislauf abgegeben, während die nicht-alphaT-Kongenere von den CYP-Enzymen zu den Carboxyethylhydroxychromanolen (CEHC) metabolisiert und über Urin und Stuhl ausgeschieden werden. Für die Aufrechterhaltung der normalen alphaT-Konzentration in Plasma und extrahepatischem Gewebe ist das TTP daher notwendig. Interessanterweise ist es möglich, das TTP auch die nicht-alphaT-Kongenere vor dem Abbau der Seitenkette schützen und so deren metabolischen Abbau verhindern kann. Ziel dieser Arbeit war unser Wissen über die nicht-alphaT-Kongenere von Vitamin E in Bezug auf ihr Vorkommen in der Nahrung, ihre intrazelluläre Lokalisation bei der Aufnahme in Leberzellen und ihre Gewebeverteilung bei Säugetieren zu erweitern. Die potentielle Rolle des TTP bei der intrazellulären Verteilung und dem Transport im Organismus der nicht-alphaT-Kongenere war ein zweiter Schwerpunkt der aktuellen Untersuchungen. Zu diesem Zweck wurden die Vitamin-E-Profile und -Gehalte in Ölen von drei Elaeis Guineensis, zwei Elaeis Oleifera und einem hybriden OxG-Palmenfrüchte-Genotyp aus Costa Rica ermittelt. Die Öle wurden entweder mechanisch mit einer Spindelpresse oder chemisch mit Hexan extrahiert. Die Vitamin-E-Profile in den Palmölen waren unabhängig vom Genotyp und Extraktionsverfahren ähnlich, alpha- und gamma-T3 waren die häufigsten Kongenere. alpha-T1 wurde in fünf der sechs Sorten gefunden. Die Extraktion mit Hexan ergab im Vergleich zur mechanischen Spindelpresse einen bis zu 2,5-fach höheren Gesamt-Vitamin E-Gehalt. Aufgrund der aus den Ölen gewonnen Erkenntnisse bezüglich der Häufigkeit der vorkommenden nicht- alphaT-Kongenere, wurden die beiden Tocotrienole für weitere Studien auf ihre zelluläre Aufnahme und intrazelluläre Verteilung in kultivierten Leberzellen mit und ohne stabiler TTP-Expression ausgewählt und mit ihren jeweiligen Tocopherol-Gegenstücken verglichen. Nach Aufnahme der vier Kongenere waren diese hauptsächlich mit den Lysosomen, dem endoplasmatischen Retikulum und der Plasmamembran assoziiert. Zusammengefasst lassen diese Ergebnisse darauf schließen, dass weder die strukturellen Unterschiede, noch die Expression des TTP ausschlaggebende Faktoren für den intrazellulären Transport (Aufnahme und Verteilung) der Kongenere in kultivierten Leberzellen sind. Abschließend wurde eine Tierstudie durchgeführt, um die Gewebeverteilung des alphaT1 bei Mäusen im Vergleich zu alphaT untersuchen. Ebenfalls wurde hierbei der Einfluss von TTP mit berücksichtigt. Wildtyp und TTP Knockout Mäuse erhielten 2 Wochen lang eine Standarddiät mit alphaT oder alphaT1. Die Konzentrationen wurden im Blut und verschiedenen Geweben bestimmt. Das alphaT1 konnte ausschließlich im Blut, nicht in den Geweben, gefunden werden. Der Verlust der TTP-Funktion bei Knockout Mäusen führte zu einer fast vollständigen Abnahme der alphaT-Konzentrationen in allen Geweben. Interessanterweise konnte alphaT1 noch im Blut nachgewiesen werden. Das Vorhandensein von alphaT1 im Blut von Mäusen mit und ohne TTP-Funktion deutet darauf hin, dass TTP für die Sekretion von alphaT1 in den systemischen Kreislauf nicht oder nur eingeschränkt erforderlich sein könnte. Aufgrund des höheren Wissenstandes über alphaT im Vergleich zu den nicht-alphaT-Kongeneren, sind auf Grundlage der vorliegenden Arbeit neue Möglichkeiten für die weitere Erforschung der biologischen Aktivitäten und den daraus resultierenden gesundheitlichen Vorteile der nicht-alphaT-Kongenere entstanden.