Analysis of the interaction between the helper component proteinase (HC-Pro) of Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) and the plant RNA methyltransferase Hua enhancer 1 (HEN1)

Abstract

The helper component-proteinase (HC-Pro) is a multifunctional protein found among potyviruses. It plays multiple roles in the viral infection cycle and some of these functions have been mapped to different regions of the protein. The subcellular localization of several viral RNA silencing suppressor (RSS) proteins was identified. In this study, we have shown that the Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) HC-Pro wild type (HC-ProFRNK) and its mutant, HC-ProFINK, had a diffuse cytoplasmic localization and formed aggregates along the endoplasmatic reticulum (ER). HC-ProFRNK and HC-ProFINK were stably expressed in N. benthamiana and A. thaliana plants. In addition, the HC-ProFRNK and HC-ProFINK were fused to a nuclear localization signal (NLS) sequence (NLS-HC-ProFRNK and NLS-HC-ProFINK) and these transgenes constructs were also stably transformed into N. benthamiana and A. thaliana. Expression of all four transgenes caused different effects in the two plant species. HC-ProFRNK?producing A. thaliana plants displayed severe phenotypic alterations. In A. thaliana, the HC-ProFINK led to a reduced number of seed set. In N. benthamiana expressing HC-ProFRNK/FINK, generally no or only slight phenotypic changes were monitored. The NLS-HC-ProFRNK/FINK-producing plants displayed clear phenotypes. Flower malformations and severe reduction of seed set were the most conspicuous observations made. In general, more severe developmental disturbances were observed in transgenic A. thaliana than in N. benthamiana plants. ZYMV HC-Pro RSS activity was previously demonstrated in N. benthamiana plants by transient expression experiments. In this study, RSS activity was confirmed in N. benthamiana lines stably expressing ZYMV HC-ProFRNK/FINK. Notably, these plants did not show significant morphological alterations. Because the RSS activity of HC-Pro leads to enhanced transgene expression, our ?symptom-free? transgenic N. benthamiana plants may serve as a platform for over-expression of foreign genes. In tobacco, transient or over-expression of rgs-CaM mimicked the phenotypic effects of Tobacco etch virus (TEV) HC-Pro, indicating that TEV HC-Pro may up-regulate rgs-CaM expression. However, our data revealed no significant difference in the levels of rgs?CaM mRNA in N. benthamiana plants expressing HC-ProFRNK/FINK when compared with the steady-state mRNA level found in the wild type plants. It is likely that RSS proteins from related viruses do not necessarily exhibit identical effects on RNA silencing. In addition, plant species might also differentially respond to identical RSS proteins. The small RNA (sRNA) binding activity of HC-Pro was evident in N. benthamiana plants co-expressing the HC-ProFRNK and an infectious transgene construct of Potato spindle tuber viroid (PSTVd). In comparison to PSTVd-infected N. benthamiana plants, Northern blot analysis showed increase accumulation of viroid-derived sRNAs in the double transformed plants. There is indirect evidence showing that in plants, transient or stable expression of HC-Pro results in decreased accumulation of methylated sRNAs. In this study, we demonstrated that recombinant ZYMV HC-Pro inhibited the methyltransferase activity of the A. thaliana Hua enhancer 1 (AtHEN1) in vitro. Moreover, we found that HC-ProFINK lacking sRNA-binding activity, also inhibited AtHEN1 activity. In contrast, truncated HC-Pro and total soluble bacterial proteins did not affect AtHEN1 activity. Using enzyme-linked immunosorbent assays, we provided evidence that the HC-ProFRNK/FINK, both bound to AtHEN1. Our results strongly indicated that inhibition of the AtHEN1 activity by HC-Pro is probably due to direct interactions between both proteins. We concluded that AtHEN1 inhibition and sRNA-binding activities of HC-Pro are independent of each other. Using the yeast two-hybrid (Y2H) system, we could show that in contrast to RSS proteins from some other viruses, the HC-ProFRNK/FINK proteins did not interact with the Argonaute 1 (AGO1) protein. Similar to previous reports our data confirmed that HC-Pro interacts with itself to form homodimers. Notably, only HC-ProFRNK but not HC-ProFINK was able to interact with itself. The conserved FRNK box is located in the central domain of HC-Pro and this domain has been previously shown to be involved in self-interaction. It should be noted that parts of the work have been published in: - Jamous R. M., Boonrod K., Fuellgrabe M. W., Ali-Shtayeh M. S., Krczal G. and Wassenegger M. (2011). The HC-Pro of the Zucchini Yellow Mosaic Virus (ZYMV) inhibits HEN1 methytransferase activity in vitro. J. Gen. Virol. 92, 2222-2226. - Fuellgrabe M., Boonrod K., Jamous R., Moser M., Shiboleth Y., Krczal G. and Wassenegger M. (2011). Expression, purification and functional characterization of recombinant Zucchini yellow mosaic virus HC-Pro. Protein Expr. Purif. 75: 40-45.

Bei der ?helper component-proteinase? (HC-Pro) handelt es sich um ein multifunktionales Protein, das bei alle Potyviren nachgewiesen wurde. Dieses Protein übernimmt verschiedene Aufgaben im Infektionszyklus der Viren. Einige dieser Funktionen konnten bestimmten Regionen des Proteins zugeordnet werden. Die subzelluläre Lokalisation zahlreicher viraler ?RNA silencing suppressor? (RSS) Proteine konnte bestimmt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die natürliche Form der ?Zucchini yellow mosaic virus? (ZYMV) HC-Pro (HC-ProFRNK) sowie die mutierte Variante, HC-ProFINK, diffuse im Zytoplasma verteilt sind. Beide Formen bilden entlang des endoplasmatischen Retikulums Aggregate. HC-ProFRNK und HC-ProFINK wurden stabil in N. benthamiana und A. thaliana Pflanzen exprimiert. Darüber hinaus wurden beide Proteine jeweils mit einer ?nuclear localization signal? (NLS) Sequenz verknüpft. Die daraus resultierenden NLS-HC-ProFRNK und NLS-HC-ProFINK Transgene wurden ebenfalls stabil in N. benthamiana und A. thaliana transformiert. Die Expression dieser vier Transgene löste unterschiedliche Effekte in den beiden Pflanzenarten aus. HC-ProFRNK-produzierende A. thaliana Pflanzen zeigten starke phänotypische Veränderungen. In A. thaliana führte HC-ProFINK zu einer reduzierten Anzahl von Samenansätzen. In N. benthamiana Pflanzen, die HC-ProFRNK/FINK exprimierten, wurden generell keine oder nur sehr schwache phänotypische Veränderungen festgestellt. NLS-HC-ProFRNK/FINK-produzierende Pflanzen zeigten hingegen deutliche Phänotypen. Dabei wurden Missbildungen der Blüten und drastische Verringerung der Samenansätze am häufigsten beobachtet. Grundsätzlich wurden bei A. thaliana stärkere Entwicklungsstörungen gefunden als bei N. benthamiana. Für N. benthamiana wurde bereits früher mittels transienter Expression nachgewiesen, dass die ZYMV HC-Pro eine RSS-Aktivität besitzt. Mit N. benthamiana Pflanzen, die die ZYMV HC-ProFRNK/FINK Proteine stabil exprimieren, wurde in der hier vorliegenden Studie die Existenz dieser Aktivität bestätigt. Bemerkenswerterweise zeigten diese Pflanzen keine auffälligen morphologischen Veränderungen. Da die RSS-Aktivität der HC-Pro zu einer erhöhten Transgenexpression führen kann, würden sich diese ?symptomfreien?, transgenen N. benthamiana Pflanzen gut für die Entwicklung einer Plattform zur Überexpression von fremden Genen eignen. In Tabak täuscht die Überexpression des rgs-CaM die phänotypischen Effekte der ?Tobacco etch virus? (TEV) HC-Pro vor. Dies deutet darauf hin, dass die TEV HC-Pro die Expression der rgs-CaM hoch reguliert. Unsere Daten zeigten allerdings keine signifikanten Konzentrationsunterschiede an rgs-CaM mRNA in den HC-ProFRNK/FINK-exprimierenden N. benthamiana Pflanzen. Es ist durchaus wahrscheinlich, dass die RSS Proteine selbst von verwandten Viren unterschiedliche Auswirkungen auf das ?RNA silencing? haben. Zudem wird vermutlich die Reaktion jeder Pflanzenart auf identische RSS Proteine unterschiedlich ausfallen. Die Bindungsaktivität von HC-Pro für kleine RNA Moleküle (sRNAs) wurde in N. benthamiana Pflanzen, die gleichzeitig die HC-ProFRNK und ein infektiöses Potato spindle tuber viroid (PSTVd) Transgenkonstrukt exprimierten, eindeutig nachgewiesen. Im Vergleich zu PSTVd-infizierten N. benthamiana Pflanzen, zeigten ?Northern blot? Analysen mit Proben aus diesen Pflanzen eine erhöhte Akkumulation viroid-spezifischer sRNAs. Einige Indizien sprachen dafür, dass in Pflanzen, welche die HC-Pro transient oder stabil exprimierten, geringere Mengen an methylierten sRNAs akkumulierten. Mit den hier durchgeführten in vitro Experimenten konnte gezeigt werden, dass die rekombinante HC-Pro die Methyltransferaseaktivität der A. thaliana Hua enhancer 1 (AtHEN1) inhibiert. Darüber hinaus haben wir herausgefunden, dass auch die HC-ProFINK, die keine sRNA Bindungsaktivität mehr besitzt, AtHEN1 inhibiert. Im Gegensatz dazu hatten verkürzte HC-Pro Proteine und eine Fraktion löslicher Bakterienproteine keinen Effekt auf die AtHEN1 Aktivität. Mit Hilfe von ?enzyme-linked immunosorbent assays? (ELISAs) wurde der Nachweis erbracht, dass beide HC-ProFRNK/FINK Proteine an die AtHEN1 binden. Unsere Ergebnisse sprechen dafür, dass die Inhibierung der AtHEN1-Aktivität durch HC-Pro auf einer direkten Interaktion zwischen den beiden Proteinen basiert. Aus diesen Resultaten lässt sich schließen, dass die Inhibierung der AtHEN1 und die sRNA-Bindungsaktivität voneinander unabhängig Eigenschaften der HC-Pro sind. Mit dem ?yeast two-hybrid (Y2H) system? konnten wir zeigen, dass die HC-ProFRNK/FINK Proteine im Gegensatz zu einigen anderen viralen RSS Proteinen nicht mit Argonaute 1 (AGO1) interagieren. Wie frühere Arbeiten, so haben auch unsere Daten gezeigt, dass HC-Pro Moleküle untereinander eine Bindung eingehen können und Homodimere bilden. Interessanterweise konnte aber nur die HC-ProFRNK nicht aber die HC-ProFINK mit sich selbst interagieren. Die konservierte FRNK Box befindet sich in der zentralen Domäne der HC-Pro, und eine Bedeutung diese Domäne für Selbstinteraktionen wurde bereits beschrieben. Es sei erwähnt, dass Teile dieser Arbeit publiziert wurden: - Jamous R. M., Boonrod K., Fuellgrabe M. W., Ali-Shtayeh M. S., Krczal G. and Wassenegger M. (2011). The HC-Pro of the Zucchini Yellow Mosaic Virus (ZYMV) inhibits HEN1 methytransferase activity in vitro. J. Gen. Virol. 92, 2222-2226. - Fuellgrabe M., Boonrod K., Jamous R., Moser M., Shiboleth Y., Krczal G. and Wassenegger M. (2011). Expression, purification and functional characterization of recombinant Zucchini yellow mosaic virus HC-Pro. Protein Expr. Purif. 75: 40-45.