Toll-like Receptor 9 (TLR9) activation and the innate immune response to microbial and human DNA

Abstract

The human Toll-like Receptor 9 (TLR9) is an endosomal Pattern Recognition Receptor (PRR) that recognizes DNA sequences containing the unmethylated Cytosine-Guanine (CpG) dimers, which are present in greater abundance in most bacterial genomes compared to those of vertebrates. Specific CpG-containing sequences are strongly stimulatory of human TLR9, as shown in published studies using synthetic oligonucleotides (ODN) and DNA from bacterial species of varying genomic CpG concentration. Human TLR9 activation was experimentally examined in this thesis using DNA extracted from different bacterial sources, human DNA from Caco-2 cells, known immunostimulatory ODN, and short ODN. In vitro assays using fragment length-standardized microbial genomic DNA on HEK-Dual TLR9 Cells and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) revealed that TLR9 activation strongly correlated to CpG concentration of the input DNA, with an additional influence of CpG-containing 5-mer TCGTT concentration. When DNA of varying origins and fragment lengths were used together, however, complex dynamics of TLR9 activation, co-activation, and repression were observed, which were less predictable than expected from genomic CpG concentration alone. DNase I-treated microbial DNA fragments of less than 15 bp of length were non-activating on their own, but co-activated human TLR9 together with ODN-2006 in Ramos Blue (B) cells. Similarly, human DNA fragments at the length of 50-200 bp co-activated human TLR9 with both ODN-2006 and Escherichia coli DNA in HEK-dual TLR9 cells. In contrast, large human DNA fragments at over 10000 bp of length repressed TLR9 activation by ODN-2006 in Ramos Blue cells. Finally, a preliminary study was conducted in HT-29 cells on the effect of TLR9 activation on the invasion of Fusobacterium nucleatum, an opportunistic gut pathogen with a very low genomic CpG concentration at 0.296%, using ODN-2006 and human DNA as TLR9 activators. While increased presence of intracellular Fusobacterium nucleatum upon treatment with both ODN-2006 and human DNA was noted, more studies are needed to confirm TLR9 activation as a cause of greater bacterial invasion. The human colon is the location of the largest microbial population of the human body, which provides a rich source of non-human DNA in contact with human TLR9 present in intestinal epithelial cells, plasmacytoid dendritic cells (pDCs), and B lymphocytes. Additionally, the daily mass shedding and death of human intestinal epithelial cells provide large amounts of human DNA, which when combined with microbial DNA could result in co-activation and possible autoimmunity. The thesis thus provided an in vitro model of TLR9 activation by complex DNA of varying origins and fragment lengths likely to present in the human gut environment, and prepared a working basis for future studies of TLR9 activation by human fecal metagenomic DNA.

Der menschliche Toll-like-Rezeptor 9 (TLR9) ist ein endosomaler Mustererkennungsrezeptor (PRR), der DNA-Sequenzen erkennt, die unmethylierte Cytosin-Guanin-Dimere (CpG) enthalten. Diese sind in den meisten bakteriellen Genomen in größerer Menge vorhanden als im Vergleich zu denen von Wirbeltieren. Spezifische CpG-haltige Sequenzen stimulieren den menschlichen TLR9 unterschiedlich stark, wie in veröffentlichten Studien mit synthetischen Oligonukleotiden (ODN) und DNA von Bakterienarten mit unterschiedlicher genomischer CpG-Konzentration zeigten. In der vorliegenden Arbeit wurde die Aktivierung des menschlichen TLR9 unter Verwendung von DNA aus verschiedenen bakteriellen Quellen, menschliche DNA aus Caco-2-Zellen, bekannte immunstimulierende ODN und kurze ODN experimentell untersucht. In in-vitro-Assays, in denen die TLR9 Aktivierung durch, mit Fragmentlängen-standardisierte mikrobielle genomische DNA in HEK-Dual TLR9-Zellen und humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) untersucht würde, zeigten dass die TLR9-Aktivierung stark mit der CpG-Konzentration Input-DNA korreliert und die CpG-haltige 5-mer TCGTT-Konzentration einen zusätzlichen Einfluss hat. Wurden jedoch DNAs unterschiedlicher Herkunft und Fragmentlängen zusammen verwendet, konnte eine komplexe Dynamik der TLR9-Aktivierung, Koaktivierung und Unterdrückung beobachtet werden, die weniger vorhersehbar war als von der genomischen CpG-Konzentration allein erwartet. Mikrobielle DNA-Fragmente mit einer Länge von weniger als 15 Basenpaaren (bp), welche mit DNase I behandelte wurden, besaßen alleine keine aktivierende Funktion. Im Zusammenspiel mit ODN-2006, konnte jedoch eine Aktivierung zusammen des menschlichen TLR9 in Ramos Blue (B)-Zellen beobachtet werden. In ähnlicher Weise ko-aktivierten menschliche DNA-Fragmente mit einer Länge von 50-200 bp den menschlichen TLR9, sowohl unter Zugabe von ODN-2006, als auch Escherichia coli DNA in HEK-dual TLR9-Zellen. Im Gegensatz dazu unterdrückten große menschliche DNA-Fragmente mit einer Länge von über 10000 bp die TLR9-Aktivierung durch ODN-2006 in Ramos Blue-Zellen. Schließlich wurde eine vorläufige Studie über die Auswirkungen der TLR9-Aktivierung in HT-29-Zellen auf die Invasion von Fusobacterium nucleatum, einem opportunistischen Darmpathogen mit einer sehr niedrigen genomischen CpG-Konzentration von 0,296%, durchgeführt. Als TLR9-Aktivatoren wurden dabei ODN-2006 und menschliche DNA verwendet. Während eine erhöhte Präsenz von intrazellulärem Fusobacterium nucleatum nach der Behandlung sowohl mit ODN-2006 als auch mit menschlicher DNA festgestellten wurde, sind weitere Studien erforderlich, um die TLR9-Aktivierung als Ursache für eine stärkere bakterielle Invasion zu bestätigen. Der menschliche Dickdarm beherbergt die größte mikrobielle Population des menschlichen Körpers. Diese stellt eine reichhaltige Quelle nicht-menschlicher DNA dar, die mit menschlichem TLR9 in intestinalen Epithelzellen, plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDCs) und B-Lymphozyten in Kontakt kommt. Darüber hinaus liefern die täglichen Ausscheidungen und das Absterben menschlicher Darmepithelzellen große Mengen menschlicher DNA, die in Kombination mit mikrobieller DNA zu einer Koaktivierung und möglicher Autoimmunität führen könnten. Die Arbeit lieferte somit ein in-vitro-Modell der TLR9-Aktivierung durch komplexe DNA unterschiedlicher Herkunft und Fragmentlänge, wie sie in der menschlichen Darmumgebung vorkommen kann, und bereitete eine Arbeitsgrundlage für künftige Studien zur TLR9-Aktivierung durch menschliche fäkale metagenomische DNA.