Entwicklung von spezifischen PCR-ELISA Nachweissystemen für Coxiella burnetii, Francisella tularensis und Orthopockenviren

Abstract

In the present work specific systems on the basis of the PCR were developed for the detection of Coxiella burnetii, Francisella tularensis and Orthopoxviruses. The detection of the pathogens is possible without additional cultivation. In order to exclude false-negative PCR results the amplification reaction was established as a competitive PCR in which an internal control DNA is included as an amplification check. With regard to a possible automation the detection-systems were constituted in form of a 'PCR ELISA'. The colorimetric detection of the amplicons takes place thereby in streptavidin coated microtiter plates. For each system biotinylated capture probes for both the internal control DNA (ST) and the pathogen specific DNA (WT) have been developed. For the use of these proof systems in the clinical laboratory, the routine application of the tested decontamination procedure by means of UNG during the execution of the PCR ELISA is recommended. For all three systems a detection of the pathogens is possible within one working day. For the species specific detection of F. tularensis and the genus specific detection of Orthopoxviruses the PCR ELISA systems established here represent the first developments of this type with integrated amplification control and potential for quantification.

In der vorliegenden Arbeit wurden auf Grundlage der PCR spezifische Nachweissysteme für Coxiella burnetii, Francisella tularensis und Orthopockenviren entwickelt. Dabei ist der Nachweis der hochpathogenen Erreger ohne zusätzliche kulturelle Anzucht möglich. Zum Ausschluß von falsch negativen PCR-Ergebnissen wurde die Amplifikationsreaktion als kompetitive PCR unter Zusatz einer internen Kontroll-DNA als Amplifikationskontrolle etabliert. In Hinblick auf eine mögliche Automatisierbarkeit wurden die Nachweissysteme in Form eines 'PCR-ELISA' konstituiert. Die kolorimetrische Detektion der Amplifikate erfolgt dabei in Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatten. Dazu wurden für die einzelnen Nachweissysteme biotinylierte Fangsonden sowohl für die interne Kontroll-DNA (ST) als auch für die Erreger spezifische Wildtyp-DNA (WT) entwickelt. Bei der Anwendung dieser Nachweissysteme im klinischen Labor wird empfohlen, das Risiko für eine Kontamination im Verlauf der Durchführung der PCR-ELISA durch die routinemäßige Anwendung des getesteten Dekontaminationsverfahrens mittels UNG zu minimieren. Mit allen drei Systemen ist ein Nachweis der Erreger innerhalb eines Arbeitstages möglich. Für den Spezies spezifischen Nachweis von F. tularensis und den Genus spezifischen Nachweis von Orthopockenviren stellen die hier etablierten PCR-ELISA Systeme die erste Entwicklung dieser Art mit integrierter Amplifikationskontrolle bzw. Möglichkeit zur Quantifizierung dar.