Recombinant production and characterization of metalloproteins from bacterial pathogens and the innate immune response

Abstract

The challenges and potential solutions of drug development are highlighted by discussing the identification, production and characterization of potential new drug targets in this study. The successful development of new and specific pharmaceuticals requires that the target for the respective new drug is available as a pure and homogenous molecule in its native state. Typically, the target molecule is a protein. E.g. antibacterial drugs target proteins from a bacterial pathogen or in human diseases pharmaceuticals predominantly target proteins of signaling pathways or receptors. These proteins are usually not available directly from the organism itself and have to be produced in an expression host and purified to homogeneity. Despite the advances in the field of recombinant protein expression and purification many proteins are very difficult to produce and thus represent the major bottleneck in the development of new pharmaceuticals. In particular demanding is the expression of metalloproteins, which make up to 30% of all proteins coded in the human genome and represent a major challenge in recombinant protein production. Metalloproteins are a diverse class of proteins that is crucial for various biological processes. They play an important role in the regulation, catalysis, and maintenance of biomolecular structure. Alone, 10% of all human proteins contain zinc ions and 2% contain iron, and both metal ions are often inserted by specific but so far unknown chaperones impeding the recombinant production of correctly folded and active proteins. The challenges in studying these metalloproteins arise from their complex structures and the difficulty of their expression and isolation. To overcome these problems new approaches and solutions are highlighted and exemplified by the production and characterization of potential new drug targets in this study. The focus lies particularly on metalloproteins that play a role in infectious diseases. Global health challenges include the persistent threat of infectious diseases despite advances in healthcare, hygiene and therapeutics. The COVID-19 pandemic and rising antibiotic resistance are prime examples of the ongoing risks. This research focuses on three different proteins: (1) the maturation factor NqrM from the bacterial pathogen Vibrio cholerae, (2) the human regulator of the interferon response ubiquitin-specific protease 18 (USP18) and its interaction partners, as well as (3) the viral Papain-like protease (PLpro) from the pathogenic virus SARS-CoV-2. All three proteins belong to the class of metalloproteins and bind either iron as in the case of NqrM or zinc as for USP18 and PLpro. New methods and strategies were developed to produce, isolate and investigate these metalloproteins and since all three proteins represent potential drug targets the results presented here provide the basis for future drug development. The production of proteins requires the selection of appropriate expression host systems such as bacteria, yeast, mammalian cells, etc., depending on the desired application. The study emphasizes the versatility of expression host E. coli due to its well-studied genetics, rapid growth kinetics and ease of handling. However, challenges such as the lack of post-translational modifications can lead to the production of non-functional proteins. Optimization of expression strategies is crucial, and the study describes various factors affecting protein production, including protein engineering, growth conditions, media composition and induction parameters expanding and enhancing the well-established E.coli expression system also for very challenging target proteins. The successful isolation of the proteins formed the fundamental basis for a detailed functional and structural characterization of the proteins. The research presented here takes a forward approach and encompasses the new strategies in cloning, recombinant expression and purification of proteins from bacteria, viruses and humans, emphasizing the advantages and disadvantages of homo- and heterologous recombinant expression. The results obtained highlight also the need for extensive experimental testing to establish optimal conditions, particularly for challenging proteins such as the metalloproteins studied here.

In dieser Studie werden die Herausforderungen und potenziellen Lösungen bei der Entwicklung von neuen Arzneimitteln, insbesondere bei der Identifikation, Produktion und Charakterisierung potenzieller neuer Arzneimittel-Ziele, hervorgehoben. Die erfolgreiche Entwicklung neuer, spezifischer Medikamente erfordert das Vorhandensein des Zielmoleküls in seiner reinen und homogenen Form. In den meisten Fällen handelt es sich bei diesen Molekülen um Proteine. Beispielsweise zielen antibakterielle Medikamente auf Proteine bakterieller Pathogene ab, während Medikamente bei humanen Erkrankungen hauptsächlich Proteine von Signalwegen oder Rezeptoren zum Ziel haben. Diese Proteine sind normalerweise nicht direkt verfügbar und müssen in einem Expressionswirt hergestellt und gereinigt werden. Obwohl es Fortschritte auf dem Gebiet der rekombinanten Proteinexpression und -aufreinigung gibt, gestaltet sich die Herstellung vieler Proteine schwierig, was den größten Engpass in der Entwicklung neuer Arzneimittel darstellt. Besonders herausfordernd gestaltet sich die Expression von Metalloproteinen, die bis zu 30% aller im menschlichen Genom kodierten Proteine ausmacht und somit eine bedeutende Hürde in der rekombinanten Proteinproduktion darstellt. Metalloproteine bilden eine facettenreiche Klasse von Proteinen, die für eine Vielzahl biologischer Prozesse von essenzieller Bedeutung sind. Sie übernehmen wichtige Funktionen bei der Regulation, Katalyse und Aufrechterhaltung der biomolekularen Struktur. Etwa 10% aller humanen Proteine enthalten Zinkionen und weitere 2% binden Eisen. Häufig erfolgt die Insertion dieser Metallionen durch spezifische, jedoch bisher unbekannte Chaperone. Dies behindert die korrekte Faltung und Aktivität bei der rekombinanten Produktion. Aufgrund der komplexen Strukturen sowie Schwierigkeiten in der Expression und Isolierung, gestaltet sich die Untersuchung von Metalloproteinen als herausfordernd. Um diesen Problemen zu begegnen, werden in dieser Studie neue Ansätze und Lösungen hervorgehoben und anhand der Produktion und Charakterisierung potenzieller neuer Wirkstoffziele veranschaulicht. Ein besonderer Fokus liegt dabei auf Metalloproteinen, die eine Rolle bei Infektionskrankheiten spielen. In Anbetracht globaler Gesundheitsherausforderungen bleibt die anhaltende Bedrohung durch Infektionskrankheiten trotz der Fortschritte in der Gesundheitsversorgung, Hygiene und Therapie bestehen. Als deutliche Beispiele für fortwährende Risiken dienen hier die COVID-19-Pandemie sowie das Problem der steigenden Antibiotikaresistenzen. Diese Forschung fokussiert auf drei unterschiedliche Proteine: (1) den Reifungsfaktor NqrM, stammend vom Bakterium Vibrio cholerae, (2) der humane Regulator Ubiquitin-spezifische Protease 18 (USP18) der Interferonantwort samt seiner Interaktionspartner und (3) die virale Papain-ähnliche Protease (PLpro) von SARS-CoV-2. Alle drei Proteine zählen zur Kategorie der Metalloproteine und binden entweder Eisen, wie im Falle von NqrM, oder Zink, wie bei USP18 und PLpro. Zur Herstellung, Isolierung und Untersuchung dieser Metalloproteine wurden innovative Methoden und Strategien entwickelt. Da sämtliche hier untersuchte Biomoleküle potenzielle Angriffspunkte für Arzneimittel darstellen, legen die hier erzielten Ergebnisse Grundsteine für zukünftige Arzneimittelentwicklungen. Die Herstellung von Proteinen erfordert, je nach angestrebter Anwendung, die sorgfältige Auswahl geeigneter Expressionssysteme wie Bakterien, Hefen, Säugetierzellen und weitere. In dieser Studie wird die Vielseitigkeit des Expressionswirts E. coli aufgrund seiner umfassend erforschten Genetik, seiner schnellen Wachstumskinetik und seiner einfachen Handhabung hervorgehoben. Dennoch können Herausforderungen wie das Fehlen von posttranslationalen Modifikationen zur Produktion von nicht-funktionalen Proteinen führen. Daher ist die Optimierung von Expressionsstrategien von entscheidender Bedeutung. Die Studie beschreibt verschiedene Faktoren, die die Proteinproduktion beeinflussen. Darunter sind das Protein- Engeneering, Wachstumsbedingungen, Medienzusammensetzung und Induktionsparameter. Durch die Berücksichtigung dieser Faktoren kann das etablierte E. coli-Expressionssystem auch für äußerst anspruchsvolle Zielproteine erweitert und verbessert werden. Die erfolgreiche Isolierung der Proteine legte den entscheidenden Grundstein für eine eingehende funktionelle und strukturelle Charakterisierung der Proteine. Die in dieser Studie präsentierte Forschung verfolgt einen wegweisenden Ansatz und umfasst neue Strategien im Bereich der Klonierung, der rekombinanten Expression und Reinigung von Proteinen aus ursprünglich Bakterien, Viren und menschlichen Zellen. Dabei werden sowohl die Vor- als auch Nachteile der homo- und heterologen Expression diskutiert. Die erzielten Ergebnisse betonen die Notwendigkeit umfassender experimenteller Tests, um optimale Bedingungen, insbesondere für anspruchsvolle Proteine wie die hier untersuchten Metalloproteine, zu schaffen.