Herstellung und Charakterisierung einer rekombinanten, sequenzspezifischen Protease zur Generierung bioaktiver Peptide

Abstract

The aim of the present thesis was the production and biochemical characterization of a sequence specific microbial protease. This enzyme should be applied in food protein hydrolyzation in order to generate bioactive peptides. To determine the substrate specificity of serine protease PRT1 from Xanthomonas campestris pv. campestris this strain was cultivated in a shaking flusk. After dialysis of the culture broth and addition of 1,10-phenantroline for metalloprotease PRT2 inactivation an enzyme activity of 0,34 nkat Caseine/mL was detected. The conversion of several chromogenic peptide substrates revealed that PRT1 does not offer a clear substrate specificity. The lysyl endopeptidase LysC from Lysobacter enzymogenes ssp. enzymogenes was obtained by cultivation of the wild type strain (ATCC 27796). In a bioreactor (1 L scale) a maximum protease activity of 0,084 nkat Tos-Gly-Pro-Lys-pNA/mL in the culture broth was detected after 45 h. The LysC gene was amplified by PCR using genomic template DNA and was cloned into the E. coli expression vector pET20b(+), leading to no detectable recombinant protease when expressed in E. coli BL21(DE3). Thus for the heterologous expression a synthetic gene construct was applied which was formerly described in literature. It contained a short N-terminal pro-sequence (MGSK) and a codon usage adapted to E. coli. The bioreactor cultivation (5 L scale) of E. coli BL21(DE3) pET20b-MGSK-LysC led to LysC inclusion bodies. The solubilization of the inclusion bodies and the following enzyme renaturation using L-arginine as an unspecific folding additive resulted in a maximum protease activity of 0,06 nkat Tos-Gly-Pro-Lys-pNA/L Culture 5h after IPTG induction. To increase the yield of recombinant protease activity the influence of the LysC propeptides on the in vitro renaturation of the protease was investigated. For this purpose both pro-peptide DNAs were sequenced, cloned and heterologously expressed in E. coli BL21(DE3). The addition of C-terminal and N-terminal propeptide to the LysC renaturation led to a maximum of 27fold (1.56 Μkat Tos-Gly-Pro-Lys-pNA/L Culture) LysC activity increasion compared to the L-arginine renaturation. As an alternative food-grade expression system the in the literature already established system of Lactobacillus plantarum NC8, L. sakei Lb790 and the E. coli-Lactobacillus shuttle vector pSIP409 was tested. However, the shaking flusk cultivations of neither L. plantarum NC8 pSIP409-MGSK-LysC nor L. sakei Lb790 pSIP409-MGSK-LysC led to detectable recombinant lysyl endopeptidase. As a possible reason therefor the different codon usage of E. coli and Lactobacillus was assumed. So expression experiments were performed using point mutated variants of the beta-galctosidase gene from Kluyveromyces lactis. It could be shown that the exchange of the serine codons tca/agt and tcc had a significant effect on the resulting enzyme activity. The exchange of three codons led to a decreation of beta-galactosidase activity of 38 %. The characterization of the recombinant lysyl endopeptidase LysC confirmed the high substrate specificity for lysine residues at P1 position. The pH and temperature optimum was 8.5 and 45°C, respectively. At 4°C and pH 9 the enzyme was stable for at least 20.5 h, whereas at 45°C only 40 % residual activity were detected after 1 h. An inhibiting effect on LysC was demonstrated for Ba2+, NH+ and PMSF. Hydrolysis of bovine caseine by LysC for generated the ACE inhibiting peptides EMPFPK, FALPQYLK, NMAINPSK and ALNEINQFYQK as well as the antioxidative VLPVPQK, which all were unambiguously identified by LC-ESI-MS/MS. Performing appropriate in vitro assays, the radical scavenging acticvity (IC50 = 4,85 Μg/mL), lipoxygenase inhibition (IC50 = 23,6 Μg/mL) and ACE inhibition (IC50 = 2,78 Μg/mL) of the caseine hydrolysate were quantified.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine sequenzspezifische, mikrobielle Protease herzustellen, biochemisch zu charakterisieren und mittels dieses Enzyms aus Lebensmittelprotein hydrolytisch bioaktive Peptide zu generieren. Um die Serin-Protease PRT1 aus Xanthomonas campestris pv. campestris bezüglich ihrer Substratspezifität zu untersuchen, wurde dieser Stamm im Schüttelkolben kultiviert. Nach Dialyse des Kulturüberstandes und Zugabe von 1,10-Phenantrolin zur Inaktivierung der Metalloprotease PRT2 konnte eine Enzymaktivität von 0,34 nkat Casein/mL detektiert werden. Der Umsatz verschiedener chromogener Peptidsubstrate zeigte, dass PRT1 keine eindeutige Substratspezifität aufweist. Die Lysyl-Endopeptidase LysC aus Lysobacter enzymogenes ssp. enzymogenes wurde durch Kultivierung des Wildstamms (ATCC 27796) gewonnen. Im Bioreaktor(1 L Arbeitsvolumen) konnte nach 45 h eine maximale Protease-Aktivität von 0,084 nkat Tos-Gly-Pro-Lys-pNA/mL im Kulturüberstand nachgewiesen werden. Das LysCGen wurde mittels PCR aus genomischer DNA amplifiziert und in den E. coli Expressionsvektor pET20b(+) kloniert. Die Expression in E. coli BL21(DE3) führte jedoch zu keiner nachweisbaren Bildung von rekombinanter Protease. Daher wurde ein bereits in der Literatur beschriebenes, synthetisches Genkonstrukt mit verkürzter N-terminaler Prosequenz (MGSK) und an E. coli angepasster ?Codon Usage? für die heterologe Expression untersucht. Die Bioreaktor-Kultivierung (5 L Arbeitsvolumen) von E. coli BL21(DE3) pET20b-MGSK-LysC führte zu rekombinanter LysC, welche in Form von ?Inclusion Bodies? in den Zellen gebildet wurde. Die Solubilisierung der ?Inclusion Bodies? und anschließende Renaturierung des Enzyms mit L-Arginin als unspezifischer Faltungshilfe ergab eine maximale Proteaseaktivität von 0,06 nkat Tos-Gly-Pro-Lys-pNA/L Kultur 5 h nach IPTG-Induktion. Um die Ausbeute an rekombinanter Proteaseaktivität steigern zu können, wurde der Einfluss der beiden LysC-Propeptide auf die in vitro Renaturierung der Protease untersucht. Hierfür wurden die Propeptid-DNA-Sequenzen aufgeklärt, kloniert und in E.coli heterolog exprimiert. Die Zugabe von C-terminalem und N-terminalem Propeptid zur LysC-Renaturierung führte zu einer bis zu 27fachen (1,56 Μkat Tos-Gly-Pro-Lys-pNA/L Kultur) Steigerung der LysC-Aktivität bezogen auf die Renaturierung mit L-Arginin. Als alternatives ?Food-grade? Expressionssystem wurde das in der Literatur etablierte Expressionssytem von Lactobacillus plantarum NC8 bzw. L. sakei Lb790 und dem E. coli-Lactobacillus Shuttle-Vektor pSIP409 eingesetzt. Jedoch konnte weder bei der Schüttelkolben-Kultivierung von L. plantarum NC8 pSIP409-MGSK-LysC noch von L. sakei Lb790 pSIP409-MGSK-LysC rekombinante Lysyl-Endopeptidase nachgewiesen werden. Da als möglicher Grund hierfür die unterschiedliche ?Codon Usage? von E. coli und Lactobacillus angenommen wurde, wurden Expressions-Experimente mit punktmutierten Varianten des beta-Galactosidasegens aus Kluyveromyces lactis durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass der Austausch des Serin-Codons tca bzw. agt gegen tcc einen deutlichen Einfluss auf die resultierende Enzymaktivität hatte. So führte der dreifache Codon-Austausch zu einer Verringerung der beta-Galactosidase-Aktivität um 38 %. Die Charakterisierung der rekombinanten Lysyl-Endopeptidase LysC bestätigte die hohe Substratspezifität für Lysinreste an P1-Position. Das pH- bzw. Temperatur-Optimum lag bei 8,5 bzw. 45°C. Bei 4°C und pH 9 war das Enzym für mindestens 20,5 h stabil, während bei 45°C nach 1 h nur noch 40 % Restaktivität gemessen werden konnten. Eine inhibierende Wirkung auf LysC zeigten Ba2+, NH4+ und PMSF. Die Hydrolyse von bovinem Casein mit LysC generierte die ACE-inhibierenden Peptide EMPFPK, FALPQYLK, NMAINPSK und ALNEINQFYQK sowie das antioxidativ wirkende VLPVPQK, die alle eindeutig mittels LC-ESI-MS/MS detektiert werden konnten. Über entsprechende in vitro Assays wurden die Radikalfänger-Aktivität (IC50 = 4,85 Μg/mL), die Lipoxygenase-Inhibierung (IC50 = 23,6 Μg/mL) sowie die ACE-Inhibierung (IC50 = 2,78 Μg/mL) des Casein-Hydrolysat quantifiziert.