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Doctoral Thesis
2022

Population genomics of herbicide resistance in Alopecurus myosuroides

Abstract (English)

Over the past 50 years, herbicides have often replaced mechanical and manual human weed control, thus representing a major factor in yield productivity in modern agriculture. Herbicide applications, however, exert strong selection pressures on weeds. As a consequence, these species have developed herbicide resistance through adaptive, beneficial alleles that increase in number to ensure the persistence of the populations, a phenomenon known as evolutionary rescue. A major research question is whether herbicide resistance adaptation is more likely to arise from standing genetic variation that was present before the onset of herbicide selection or from de novo mutations that arose after herbicide selection began. To address this question, I focused on target-site resistance (TSR) point mutations, which cause a lower binding affinity to the target protein of the respective herbicides. I first investigated the diversity of TSR haplotypes in populations of the grass species Alopecurus myosuroides (common name: blackgrass), and compared it with the TSR diversity outcome of simulated populations under both evolutionary scenarios. I first conducted a population genetics study of A. myosuroides, which is the most problematic weed in winter cereals across the European continent due to rapid resistance evolution. To obtain genome-wide polymorphic markers, I adapted a restriction site-associated DNA sequencing protocol to this species. I began by analyzing the diversity and population structure in a smaller local South German collection. The fact that I could differentiate populations on a local scale motivated me to extend the study to a European-wide collection, in which I found clear population structure, albeit with low differentiation and some evidence for admixture across Europe. In addition, I generated highly accurate long-read amplicons from single individuals of two loci, ACETYL-COA CARBOXYLASE (ACCase) and ACETOLACTATE SYNTHASE (ALS), which are the targets of the two main herbicide modes of action used in European cereal crops. I obtained completely phased haplotype information, supporting the analysis of haplotype diversity on a population level. I found a remarkable diversity of beneficial TSR mutations at the field level arising from multiple haplotypes of independent origin, so called soft sweeps. I used this information to perform forward simulations to investigate the evolutionary origin of these mutations. I found evidence that a majority of resistance mutations originated from standing genetic variation. While this at first may appear surprising, it is consistent with very large census and effective population sizes in blackgrass. Since long-read amplicon sequencing of single individuals could be costly and time consuming, I extended the analysis to pools of 150 to 200 individuals from Germany, Belgium, France, the Netherlands and the United Kingdom. By combining the power of a more stringent accuracy criterion in our long-reads and a novel clustering software (PacBio amplicon analysis), I was able to preserve individual haplotype information in pooled samples. Furthermore, in a proof of concept experiment, I was able to recover in our pools most haplotypes previously sequenced in individuals. The amplicon study provides a versatile workflow that can be easily adapted to any gene of interest in different species. In conclusion, I found that many A. myosuroides populations likely already have the genetic prerequisites not only for rapid evolution of resistance to currently used herbicides, but also to herbicides that have not yet been brought to market.

Abstract (German)

In den letzten 50 Jahren haben Herbizide größtenteils die mechanische und manuelle Unkrautentfernung durch den Menschen ersetzt und bilden damit einen wichtigen Beitrag zur Ertragsstabilität in der modernen Landwirtschaft. Der Einsatz von Herbiziden übt jedoch einen starken Selektionsdruck auf Unkräuter aus. Infolgedessen haben diese Arten eine Herbizidresistenz entwickelt, welche mit dem Anstieg von adaptiven, vorteilhaften Allelen einhergeht und so den Fortbestand der Populationen sichert - ein Phänomen, das als evolutionäre Rettung bekannt ist. Hier stellt sich die Frage, ob die Herbizidresistenz als bestehende genetische Variationen in den Populationen bereits vor Beginn der Herbizid-Selektion vorhanden ist oder aus de-novo Mutationen hervorgeht, die nach Beginn der Herbizid-Selektion entstanden sind. Um diese Frage zu klären, habe ich mich auf Punktmutationen der Target-Site-Resistenz (TSR) konzentriert, die eine geringere Bindungsaffinität zum Zielprotein des jeweiligen Herbizids bewirken. Dazu analysierte ich die Diversität der TSR-Haplotypen in Populationen der Grasart Alopecurus myosuroides (allgemein: Ackerfuchsschwanz) und verglich sie mit dem Ergebnis der TSR-Diversität simulierter Populationen unter beiden Evolutionsszenarien. Als Erstes führte ich eine populationsgenetische Studie in A. myosuroides durch, welches aufgrund der schnellen Resistenzentwicklung das problematischste Unkraut beim Anbau von Wintergetreide in Europa ist. Um genomweite polymorphe Marker zu generieren, habe ich ein Protokoll zur Erzeugung von Restriktionsstellen-assoziierten DNA-Markern an diese Grasart angepasst. Zunächst analysierte ich die Diversität und Populationsstruktur in einer kleineren lokalen süddeutschen Sammlung. Die Tatsache, dass ich Populationen auf lokaler Ebene unterscheiden konnten, motivierte mich, die Studie auf eine europaweite Sammlung auszudehnen. Dort zeigte sich eine klare Populationsstruktur, wenn auch mit einer geringen Differenzierung, sowie Hinweise auf genetische Vermischungen in ganz Europa. Darüber hinaus generierte ich hochpräzise Long-Read Amplikons von einzelnen Individuen der beiden Gene ACETYL-COA CARBOXYLASE (ACCase) und ACETOLACTAT SYNTHASE (ALS), welches die Zielgene der beiden wichtigsten herbiziden Wirkmechanismen im Getreideanbau sind. Ich erhielt vollständig phasierte Haplotyp Informationen, die es mir ermöglichten, die Haplotyp-Diversität auf Populationsebene zu analysieren. Ich fand eine bemerkenswerte Vielfalt an vorteilhaften TSR-Mutationen auf Feldebene, die aus mehreren Haplotypen unabhängigen Ursprungs, so genannten Soft Sweeps, hervorgingen. Diese Informationen konnte ich für Vorwärts-Simulationen nutzen, um den evolutionären Ursprung dieser Mutationen näher zu untersuchen. Ich fand Hinweise darauf, dass die Mehrzahl der Resistenzmutationen aus bestehenden genetischen Variationen hervorgegangen sind. Dies mag auf den ersten Blick überraschen, steht aber im Einklang mit den hohen effektiven Populationsgrößen von Ackerfuchsschwanz. Da die Long-Read Amplikon Sequenzierung von Einzelindividuen kostspielig und zeitaufwändig sein kann, habe ich meine Methode auf Pools von 150 bis 200 Individuen aus Deutschland, Belgien, Frankreich, den Niederlanden und dem Vereinigten Königreich ausgedehnt. Durch die Erhöhung der Read Genauigkeit und mit Hilfe der neuartigen Clustering-Software (PacBio amplicon analysis) war ich in der Lage, individuelle Haplotyp-Informationen in den gepoolten Proben zu erhalten. Darüber hinaus konnte ich die meisten Haplotypen, die zuvor als Einzelproben sequenziert worden waren, in unseren Pools identifizieren. Die Amplikon Pool Methode kann leicht an jedes Gen von Interesse in verschiedenen Arten angepasst werden. Ich komme zu dem Schluss, dass in vielen A. myosuroides Populationen die genetischen Vorraussetzungen für eine rasche Resistenzentwicklung höchstwahrscheinlich bereits vorhanden sind. Dies betrifft nicht nur Herbizide, die derzeit verwendet werden, sondern auch Wirkstoffe, die noch nicht auf dem Markt sind.

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Faculty
Faculty of Agricultural Sciences
Institute
Institute of Plant Breeding, Seed Science and Population Genetics

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2022-12-08

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English

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Classification (DDC)
630 Agriculture

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