Analyse von Pathogenresistenzmechanismen in Tomate (Solanum lycopersicum L.)

Abstract

For many organisms plants serve as a source of nutrients and energy, but because of their static location they are exposed to various harmful environmental influences. Due to this factor they have developed complex defence mechanisms e. g. for protection against pathogens. An important aspect of these defence mechanisms is the expression of intrinsic resistance genes (R) that detect pathogenic avirulence gene products (Avr) thereby causing a hypersensitive response (HR) in the infected cells and consequently inhibiting the systemic infection of the plant. In this work the resistance genes Tm-2 and Tm-2² of tomato were isolated, cloned and sequenced. The allelic R genes are members of the CC-NBS-LRR group of resistance genes, which is widely spread in plants, and differ only in four amino acids. This is surprising because using resistance breaking ToMV strains Weber et al. (2004) showed that both resistance gene products interact differently with the movement protein (30 kDa MP = Avr) of the virus. To gain further insight into this phenomenon of different pathogen detection, chimeric exchange constructs (A1 and A2) were designed through restriction in the region between the NBS and the LRR domain. These four constructs were used for transformation of MM tomatoes as well as NN and nn tobacco plants. The expression of the resistance gene constructs in MM an nn lines did not confer the expected resistance to ToMV. Nevertheless in older infected nn transformants a formation of spontaneous necrosis was observed, which indicates a delayed development of HR. One possible explanation could be that the presence of only the resistance gene product is not sufficient to detect the viral movement protein and that other host cellular components are involved in this process (as in the guard hypothesis by Dangl and Jones, 2001). This assumption is supported by our yeast two hybrid interaction experiments which showed that a direct interaction of Tm-2 and 30 kDa MP can be excluded. For the NN transformants differences in functionality of the constructs was observed. While NN/Tm-2 and NN/A2 plants showed extreme resistance to ToMV wild type (ToMV0) and the Tm-2² resistance breaking strain ToMV2², the Tm-2² and A1 constructs conferred less resistance to ToMV0 and the Tm-2 resistance breaking strain ToMV1-2. This finding also supports the assumption that there is a difference in pathogen detection between the two alleles. Furthermore it shows that the detection takes place within the LRR region because the exchange construct that behaves in the same way as the endogenous resistance gene carries the C-terminal LRR domain of this allele. The hydroxycinnamoyl-CoA:tyramine N-(Hydroxycinnamoyl)transferase (THT) was found to be another candidate for transmission of pathogen resistance during HR (Gerhardts, 2003). Our in vivo results show that the products of the THT enzymatic reaction induced during HR does not only have an antimicrobiotic effect on the pathogen (von Roepenack-Lahaye et al., 2003; Newman et al., 2001) but also has an apoptotic effect on the plant cell itself.

Pflanzen dienen vielen Lebensformen als Nahrungsquelle und Energielieferant und sind nicht zuletzt aufgrund ihrer Standortgebundenheit vielen schädigenden Umwelt-einflüssen ausgesetzt. Aufgrund dessen haben sie komplexe Abwehrmechanismen entwickelt, die sie beispielsweise vor dem Befall durch Pathogene schützen. Ein wichtiger Bestandteil dieser Abwehrmechanismen ist die Expression pflanzeneigener Resistenzgene (R), welche pathogene Avirulenzgenprodukte (Avr) erkennen, dadurch eine hypersensitive Reaktion (HR) in der Pflanzenzelle auslösen und somit eine systemische Infektion der Pflanze verhindern. Im Zuge dieser Arbeit wurden die Resistenzgene Tm-2 und Tm-2² aus Tomaten-pflanzen isoliert, kloniert und sequenziert. Die allelen R-Gene gehören zur Gruppe der CC-NBS-LRR-Resistenzgene, die im Pflanzenreich weit verbreitet ist, und unter-scheiden sich lediglich in vier Aminosäuren. Dies ist insofern erstaunlich, da durch Resistenz durchbrechende ToMV-Stämme gezeigt wurde, dass beide Resistenzgen-produkte unterschiedlich mit dem Transportprotein von ToMV (30 kDa MP = Avr) interagieren (Weber et al., 2004). Aus diesem Grund wurden durch einen Restriktionsschnitt im Bereich zwischen der NBS- und der LRR-Region chimäre Austauschkonstrukte (A1 und A2) der Resistenzgene erstellt, um Unterschiede in der Pathogenerkennung untersuchen zu können. Mit den vier Konstrukten wurden sowohl MM-Tomaten- aus auch nn- und NN-Tabakpflanzen transformiert. Die Expression der Resistenzgenkonstrukte in MM- und nn-Linien führte nicht wie erwartet zur Resistenzvermittlung gegenüber ToMV. Allerdings zeigte sich in älteren infizierten nn-Transformanden eine spontane Bildung von Blattnekrosen, was auf eine verspätet einsetzende HR hinweist. Dies lässt sich erklären, indem man davon ausgeht, dass die Anwesenheit des Resistenzgenproduktes alleine nicht zur Er-kennung des viralen Transportproteins ausreicht, sondern dass andere pflanzliche Komponenten an diesem Prozess beteiligt sind (wie beschrieben in der Guard-Hypothese nach Dangl und Jones, 2001). Dafür sprechen auch die Ergebnisse der durchgeführten Interaktionstests im Hefe-Zweihybridsystem, aufgrund derer eine direkte Interaktion zwischen Tm-2 und 30 kDa MP ausgeschlossen werden kann. In den NN-Transformanden wurden Unterschiede in der Funktionalität der Konstrukte sichtbar. Während bei NN/Tm-2- und NN/A2-Pflanzen eine extreme Resistenz gegenüber dem ToMV Wildtyp (ToMV0) und dem Tm-2²-Resistenz durchbrechenden Stamm ToMV2² auftrat, waren die Konstrukte Tm-2² und A1 weniger funktionell gegenüber ToMV0 und dem Tm-2-Resistenz durchbrechenden Stamm ToMV1-2. Auch dieses Ergebnis deutet auf Unterschiede zwischen den Allelen in der Pathogenerkennung hin; außerdem zeigt es, dass die Erkennung innerhalb der LRR-Region stattfindet, da die Austauschkonstrukte, welche sich den natürlichen Resistenzgenen gleich verhalten, jeweils deren C-terminale LRR-Domäne tragen. Ein weiterer Kandidat zur Pathogenresistenzvermittlung im Zuge der HR wurde in der Hydroxycinnamoyl-CoA:Tyramin N-(Hydroxycinnamoyl)transferase (THT) gefunden und untersucht (Silber, 2001; Gerhardts, 2003). In dieser Arbeit konnte in vivo gezeigt werden, dass die Produkte der Enzymreaktion der THT, welche im Zuge der HR gebildet werden, nicht wie angenommen eine rein antimikrobielle Wirkung gegenüber einem Pathogen zeigen (von Roepenack-Lahaye et al., 2003; Newman et al., 2001), sondern auch eine zelltodfördernde Wirkung auf die Pflanzenzelle selbst haben.