Zur Genese der Innenohr-Otolithen bei Knochenfischen (Oreochromis mossambicus) unter besonderer Berücksichtigung von Matrixproteinen

Abstract

Vertebrate calcified structures are involved in the construction of several tissues e.g. bones, teeth, scales and inner ear otoliths. The underlying biomineralization process largely differs from parameters of non-biological mineralization issues as they occur e.g. in geology. These differences are mainly based on proteins, which control the incorporation and aggregation of inorganic substances. In contrast to bones, which are composed cellular and consist of calcium phosphate, the completely acellular inner ear otoliths and otoconia are built out of calcium carbonate. The fish otoliths serve as counter-mass in the sensory organs of hearing and balance. These ear stones are an appropriated system to investigate the process of biomineralization, because their mineralization takes part in the closed environment of the inner ear and they are easy to remove without any other tissue residues. The inner ear is highly conserved among the vertebrates, from fish up to humans. The vertebrate inner ear is a complex labyrinth containing multiple sensory organs, the semicircular canals with the rotation-sensing cristae and the otolithic organs. The otolithic organs (utricule, saccule and lagena) of teleosts are saccular structures. The fish utricule serve primary vestibular function in contrast to the saccule and lagena, which serve auditory functions. Little is known about the formation of otoliths and otoconia but several proteins involved in their biomineralization are identified. These proteins serve only 0.1-10% in the weight of otoliths, but they accomplish several important function during the biomineralization process. These proteins build a matrix, which directly controls the biomineralization e.g. regulation of the crystals strength and the selection of the crystal polymorph. Several proteins of fish otoliths, and in their orthologous structures in mammals, the otoconia, are identified like otoconin, otolith matrix protein-1 (OMP-1), otolin-1, starmaker, SPARC, myosin light chain 9, neuroserpin and osteopontin, but their function during otolith or otoconia mineralization is only partly known.

The aim of this study is the analysis of the regulation, synthesis and deposition of otolith matrix proteins in the cichlid fish Oreochromis mossambicus, with special attention on gravitational effects. Moreover, the function of the otolith matrix proteins, if they occur in other mineralization processes, like in bones and teeth, is also of interest. The present dissertation adduced mainly the following results: 1. Occurrence of otolith matrix proteins in the inner ear of sub-adult cichlid fish (Oreochromis mossambicus) was detected with an enhanced protein purification technique In a set of experiments, the composition of this proteinous matrix was analyzed by mass spectrometry in a shotgun approach. Therefore an enhanced protein purification technique was developed that can exclude any contamination of proteins from body fluids. In the use of that method eight proteins were identified, the common otolith matrix proteins OMP-1, otolin-1, neuroserpin, SPARC and otoconin, and three previously unidentified alpha tectorin, otogelin and transferrin. Moreover, it was able to exclude the occurrence of two matrix proteins (starmaker and pre-cerebellin like protein) known from other fish species. In further analysis it was shown, that the absence of the otolith matrix protein starmaker corresponds to calcitic otoliths and that even pre-cerebellin like protein did not occur during the whole otolith development in the inner ear. Moreover, the source of another matrix protein, neuroserpin, which was identified in the hypothalamus was also focused on. In consequence, generally some known otolith proteins seem to be not required in all fish species and further functional studies of the new identified proteins during otolith development are required. 2. Formation of the inner ear during embryonic and larval development of a cichlid fish (Oreochromis mossambicus) characterized otolith matrix protein expression and morphological markers The formation of otoconia and otoliths is discussed to be a stepwise process and it is in fish generally divided in an aggregation of the otolith primordia from precursor particles and in a growth process continuing throughout life. In the present dissertation, the complex transition between these two steps was investigated. Therefore the developmental profiles of the otolith matrix proteins (OMP-1, otolin-1, neuroserpin, SPARC otoconin, alpha tectorin, otogelin and transferrin) was analyzed during the complete embryonic and larval development of the cichlid fish Oreochromis mossambicus, parallel to the morphology of inner ear and especially otoliths. In a set of experiments, it was able to prove that the formation of otoliths is a highly regulated temporal and spatial process, which takes part during the complete fish embryonal and larval development. Based on the data eight phases of otolith differentiation were defined, from the primordia to definitively structured otolith. 3. Spatial expression of otolith matrix protein-1 and otolin-1 in normally and kinetotically swimming fish Repeatedly it has been shown that some fish of a given batch reveal motion sickness (a kinetosis) following the transition from 1g to microgravity or from hypergravity (centrifuge) to 1g. It was suggested that the susceptibility to kinetosis is correlated with an irregular inner ear otolith growth (e.g. leading to asymmetric otoliths or to an abnormally otolith morphology). Otoliths are mainly composed of calcium carbonate and matrix proteins, which play an important role in the process of otolith mineralization. Concerning the morphology of otoliths ? thus possibly leading to the susceptibility to kinetosis - the expression of the major otolith proteins OMP-1 and otolin-1 was of special interest. In a series of hypergravity experiments, the spatial distribution of OMP-1 and otolin-1 in the utricule and saccule of kinetotically and normally behaving fish was analyzed by means of in-situ hybridization on transverse cryostat sections. In the utricule, OMP-1 was mainly observed in centripetal (medial) and centrifugal (lateral) macula, the regions of the meshwork areas. In the saccule, OMP-1 was expressed within a dorsal and a ventral narrow band of the meshwork area opposite to the periphery of the otoliths sulcus acusticus. Quantifying the OMP-1 positive areas, it was investigated that the expression in the utricule reached farther posterior in the centrifugal aspect and was considerably broader in the centripetal portion of the utricle in normally swimming fish as compared to kinetotic animals. Differences in the saccule were not observed for both genes. The difference in the utricular OMP-1 expression pattern between normally and kinetotically swimming fish indicates a different otolith morphology and thus a different geometry of the otoliths resting on the corresponding sensory maculae. As the utricle is the endorgan responsible for sensing gravity, an aberrant morphology of the utricular otoliths, based on OMP-1, thus might lead to kinetotic behavior. 4. Developmental expression of SPARC and the osteopontin-like protein in the cichlid fish Oreochromis mossambicus. Bones are mainly composed of calciumhydroxyapatite and a proteinous matrix. In this dissertation the non-collagenous bone matrix proteins - the fish osteopontin orthologous protein (osteopontin-like protein; OP-L) and SPARC - were of special interest. The current knowledge about the expression of OP-L is fragmentary. Therefore, first the expression pattern of OP-L in the cichlid fish Oreochromis mossambicus was analyzed in detail during its larval development. OP-L expression was only identified in those tissues that underwent ossification in the developing bones and teeth, in contrast to the mammalian osteopontin, which was found, beside the calcified tissues, also in several soft tissues. Therefore, it was focused on the developmental appearance of SPARC and OP-L in the whole cranial and post cranial development. In a set of experiments, it was able to show, that there is a fundamental difference in the formation of the cartilages of splanchnocranium and all other cartilages, concerning the SPARC expression. SPARC functions in the cascade, regulating cartilage differentiation of the splanchnocranium, the eldest part of the fish skeleton, whereas it was not detected in that of the chondrocranium and axial skeleton. These findings are probably based on the different evolutionary background of the splanchnocranium. Moreover, it was able to show that during osteogenesis initial expression of the bone matrix proteins OP-L and SPARC coincidentally appear with the initial calcium carbonate deposition. This result indicates a co-occurrence of the initial calcium deposition and the appropriation of bone matrix proteins during osteogenesis. 5. The anosteocytic bone syncytium in fish: A new intracellular ossification detected by molecular biological, histological and enzyme-histochemical methods The bones of most fish are referred as ?acellular? or anosteocytic bone and no osteocytes occur within this osseus. It was assumed, that during the development the osteoblasts, which secrete collagen and ground substance, recede from the mineralizing front (preosseous matrix) and never become trapped as osteocytes in mammals do. Therefore it was assumed, that this is the only difference to mammalians. Typical osteoblasts with an alkaline phosphatase activity in fish only occur at the outer surface of the outgrowing bone parts. Therefore, the cells that might be responsible for the further growth of the anosteocytic bones, up to now have not been investigated. In this dissertation it was shown, that the osseus of the anosteocytic bone itself comprised mRNA and shows a cytoplasmic character. Furthermore, the results suggest that the formation of the osseus may possibly take part intracellular in a syncytium. Based on the findings concerning the occurrence RNA and carbonic anhydrase activity, which accompany with a change in the bone mineral system and additionally with a fractional occurrence of a plasma membrane between the spindle shaped osteocytes and the osseus, a new model for the intracellular bone formation in teleost fish was developed.

Calzifizierte Strukturen von Wirbeltieren sind am Aufbau verschiedener Gewebe, wie z.B. Knochen, Zähnen, Schuppen und die Otolithen des Innenohres, beteiligt. Der zugrunde liegende Biomineralisationsprozess unterscheidet sich in verschiedenen Parametern von der z.B. aus der Geologie bekannten abiotischen Mineralisation. Die Unterschiede resultieren aus Proteinen, welche den Einbau und die Aggragation von anorganischen Substanzen direkt kontrollieren. Im Gegensatz zu Knochen, welcher zellulär aufgebaut ist und aus Calciumphosphat besteht, sind die Innenohrotolithen von Fischen komplett azellulär aufgebaut und bestehen aus Calciumcarbonat. Diese Innenohrsteine dienen als Gegengewichte, welche zur auditiven wie auch zur vestibulären Wahrnehmung genutzt werden. Die Otolithen sind ein geeignetes Modellsystem zur weiteren Untersuchung von Biomineralisationsvorgängen, da deren Mineralisierung in einem geschlossenen Milieu (dem Innenohr) stattfindet und diese einfach und ohne Gewebsverunreinigungen zu präparieren sind. Das Innenohr ist innerhalb der Vertebratenreihe hoch konserviert, von Fischen bis hin zum Menschen. Es ist ein komplexes Labyrinth welches verschiedene Sinnesorgane, wie die semizirkulären Kanäle mit den sensorischen Cristae (Wahrnehmung von Rotationsbeschleunigungen) und die otolithischen Organe (Schwerkraftperzeption und Hören), beinhaltet. Die otolithischen Organe (Utriculus, Sacculus und Lagena) sind bei Fischen als sackähnliche Strukturen ausgebildet, wobei der Utriculus primär der vestibulären und der Sacculus, wie auch die Lagena, zur auditiven Wahrnehmung dienen. Über die Bildung der Otolithen von Fischen und den Otoconien von Säugern bestehen nur fragmentarische Erkenntnisse, jedoch wurden einige der an ihrer Biomineralisation beteiligten Protein identifiziert. Diese Proteine machen nur 0,1 - 10% des Gewichtes eines Otolithen aus, jedoch spielen sie verschiedene bedeutende Rollen in deren Mineralisierung. Diese Proteine bilden eine Matrix, welche den Biomineralisationsvorgang direkt steuert, z.B. Regulation der Kristallgröße und die Selektion des Kristallpolymorphes. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Analyse der Regulation, Synthese und Deposition der Otolithenmatrixproteine des Cichliden Oreochromis mossambicus in Abhängigkeit von Schwerkraft bedingten Effekten. Des Weiteren war die Beteiligung der Otolithenmatrixproteine an anderen Mineralisationsprozessen, wie z.B. der von Knochen, Zähnen und Schuppen, von Interesse. Die vorliegende Arbeit erbrachte im Wesentlichen die folgenden Ergebnisse: 1. Identifizierung von Otolithenmatrixproteinen im Innenohr von sub-adulten Cichliden (Oreochromis mossambicus) durch eine verbesserte Proteinaufreinigungstechnik In verschiedenen Experimenten wurde die Zusammensetzung der Proteinmatrix der Otolithen mit Hilfe von Massenspektrometrie in einem ?shotgun? Ansatz analysiert. Hierzu wurde eine verbesserte Proteinaufreinigungstechnik entwickelt, mit deren Hilfe eine Kontamination durch Körperflüssigkeiten ausgeschlossen werden konnte. Mit Hilfe dieser Technik wurden acht bekannten Matrixproteine (OMP-1, Otolin-1, Neuroserpin, SPARC und Otoconin) nachgewiesen, sowie drei bis dahin unidentifizierte (alpha tectorin, Otogelin und Transferrin). Weiterführend konnte das Vorkommen der aus anderen Fischarten bekannten Matrixproteine Starmaker und Pre-cerebellin like Protein in Cichliden ausgeschlossen werden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass das Fehlen von Starmaker mit den hauptsächlich aus Kalzit bestehenden Otolithen von Oreochromis mossambicus korreliert. Des Weiteren konnte gezeigt werden, das Pre-cerebellin like Protein während der kompletten Otolithenentwicklung im Innenohr von Cichliden nicht vorkommt. Ein weiterer Schwerpunkt lag zunächst bei der Herkunft des Matrixproteins Neuroserpin, welches im Hypothalamus nachgewiesen werden konnte. Aufgrund der erzielten Ergebnisse scheinen einige der bis dahin bekannten Matrixproteine nicht generell in allen Fischarten für die Otolithenbildung benötigt zu werden. Zudem werden weiterführende funktionelle Studien über die Rolle der neu identifizierten Otolithenmatrixproteine während der Otolithenmineralisation benötigt. 2. Genese des Innenohres während der embryonalen und larvalen Entwicklung in Cichliden (Oreochromis mossambicus), charakterisiert durch die Expression von Otolithenmatrixproteinen und morphologischen Markern Es wird angenommen, dass es sich bei der Bildung von Otolithen und Otoconien um einen schrittweisen Prozess handelt. Dieser Prozess ist in Fischen generell in eine frühe Aggregation der Otolithenprimordien (ausgehend von Vorgängerpartikeln) und in einen über die Lebensspanne des Fisches andauernden kontinuierlichen Wachstumsprozess unterteilt. In der vorliegenden Dissertation war der komplexe Übergang zwischen diesen zwei Schritten von besonderem Interesse. Hierzu wurden die Entwicklungsprofile der Otolithenmatrixproteine (OMP-1, Otolin-1, Neuroserpin, SPARC Otoconin, alpha Tectorin, Otogelin and Transferrin) und verschiedener morphologischen Marker der Innenohr- und Otolithenentwicklung erstellt. Diese Analyse beinhaltete die komplette embryonale und larvale Entwicklung von Oreochromis mossambicus. Hierbei konnte in verschiedenen Experimenten nachgewiesen werden, dass es sich bei der Bildung der Otolithen um einen hoch regulierten temporalen und spatialen Prozess handelt, welcher sich fast über die komplette embryonale und larvalen Fischentwicklung erstreckt. Basierend auf den erzielten Ergebnissen wurden acht Phasen der Otolithen Differenzierung definiert, vom Primodium zum vollständig strukturierten Otolithen. 3. Spatiale Expression der Otolithenmatrixproteine Otolith matrix protein-1 und Otolin-1 in normal und kinetotisch schwimmenden Fischen Es konnte wiederholt gezeigt werden, dass einige Fische eines bestimmten Kollektives Bewegungskrankheiten (Kinetosen) beim Übergang von 1g zu Schwerelosigkeit, oder von Hypergravitation (Zentrifuge) zu 1g, zeigen. Es wird angenommen, dass die Anfälligkeit für Kinetosen mit irregulärem Otolithenwachstum korreliert, welches z.B. zu asymetrischen oder abnorm geformten Otolithen führt. Die Otolithen bestehen hauptsächlich aus Calciumcarbonat und einer Proteinmatrix, welche eine bedeutende Rolle in deren Mineralisierung spielt. Hierbei sind die Hauptbestandteile der Otolithen-Proteinmatrix, OMP-1 und Otolin-1 sowie ihre Beteiligung an der Ausprägung der Otolithenmorphologie und damit im Zusammenhang mit der Anfälligkeit für Kinetosen, von besonderer Bedeutung. In einer Serie von Hypergravitationsexperimenten wurde die räumliche Verteilung von OMP-1 und Otolin-1 im Utriculus und Sacculus von sich kinetotisch und normal verhaltenden Fischen durch in-situ Hybridisierung auf Cryostatschnitten untersucht. Im Utriculus wurde OMP-1 in den centripetalen (medial) and centrifugalen (lateral) Regionen, den sogenannten ?meshwork areas? nachgewiesen. Im Sacculus hingegen kommt OMP-1 in den dorsalen und ventralen ?meshwork areas? vor, wobei diese Gebiete mit den peripheren Gebieten des Sulcus acusticus der Sagitta korreliert werden konnten. Durch Quantifizierung der OMP-1 positiven Gebiete konnte gezeigt werden, dass sich die Expression im Utriculus im zentrifugalen Aspekt in normal schwimmenden Versuchstieren breiter und weiter posterior ausdehnt als in Tieren die sich kinetotisch verhalten. Im Sacculus konnten keine Unterschiede nachgewiesen werden. Der Unterschied in den OMP-1 positiven Ragionen des Utriculus zwischen normal und kinetotisch verhaltenden Tieren deutet auf eine unterschiedliche Otolithenmorphologie und somit eine unterschiedliche Geometrie der Maculakontaktseite des Otolithen hin. Da der Utriculus primär der Schwerkraftwahrnehmung dient könnte eine abnorm Morphologie des Lapillus, basierend auf der OMP-1 Expression, zu kinetotischem Verhalten führen. 4. Expression von SPARC uns dem Osteopontin-like Protein während der Entwicklung von Oreochromis mossambicus Die Knochen von Vertebraten bestehen hauptsächlich aus Calciumhydroxyapatit und einer Proteinmatrix. In der vorliegenden Arbeit waren die nicht-Kollagenen Hauptbestandteile der Knochenmatrix, das Osteopontin orthologe Protein von Fischen (Osteopontin-like Protein; OP-L) und SPARC, von besonderem Interesse. Über die spezifische Expression von OP-L existieren gegenwärtig nur fragmentarische Kenntnisse, somit wurde zum ersten mal die spezifische Expression von OP-L im Cichliden Oreochromis mossambicus während der kompletten larvalen Entwicklung detailliert analysiert. Hierbei konnte der Nachweis erbracht werden, dass OP-L ausschließlich in ossifizierenden Geweben vorkommt, wie in den sich entwickelnden Knochen und Zähnen. Im Gegensatz hierzu wurde in Säugern Osteopontin neben den calzifizierten auch in verschiedenen uncalzifizierten Geweben nachgewiesen. Aufgrund des Vorkommens von OP-L in ossifizierten Geweben, war das Auftreten von OP-L und SPARC wärend der Skelettentwicklung des cranialen und postranialen Skelettes, in der vorliegenden Arbeit von besonderer Bedeutung. In verschiedenen Experimenten konnte gezeigt werden, dass es einen fundamentalen Unterschied, bezüglich des Auftretens von SPARC in der Chondrogenese des Splanchnocraniums, verglichen mit der Genese der anderen knorpeligen Skelettelemente, gibt. SPARC ist an der Kaskade welche zur Differenzierung des Splanchnocraniums, dem ältesten Teils des Skelettes, führt beteiligt. Im Gegensatz hierzu konnte SPARC in der frühen Entwicklung des Chondrocraniums und des Achsenskelettes nicht nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis resultiert möglicherweise aus dem unterschiedlichen evolutionären Hintergrundes des Splanchnocraniums. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass während der Genese der Schädelknochen die beginnende Calzifizierung hauptsächlich mit dem ersten Auftreten von OP-L und SPARC korreliert. Dieses Ergebnis weist auf ein gleichzeitiges Vorkommen der ersten Calziumdeposition und der Bereitstellung der Knochenmatrixproteine während der Osteogenese hin. 5. Das anosteocytische Knochensynzytium von Fischen: eine neue intrazellulläre Ossifikation, nachgewiesen durch moleklarbiologische, histologische und enzymhistochemische Methoden.Die Knochen der meisten Fische sind im Allgemeinen als azellulär oder anosteozytisch bekannt. Dies bedeutet, dass innerhalb des Knochengewebes (Osseus) keine Osteozyten vorkommen. Es wird angenommen, dass sich während der Knochenentwicklung die Osteoblasten, welche die Grundsubstanz und das Kollagen sekretieren, von der mineralisierenden Front (Prä-Knochenmatrix) zurückziehen und so nicht als Osteozyten (wie z.B. bei Säugern) eingeschlossen werden. Es wurde generell angenommen, dass dies der einzige Unterschied zu den Knochen von Säugern darstellt. Typische Osteoblasten mit alkalischer Phosphataseaktivität jedoch kommen in Fischen nur an der Oberfläche auswachsender Knochenteile vor und diejenigen Zellen, welche für das weitere Knochenwachstum verantwortlich sind, wurden bisher nicht identifiziert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das anosteozytische Knochengewebe selbst mRNA enthält und ein zytoplasmatischen Charakter hat. Des Weiteren legen die erzielten Ergebnisse nahe, dass die Bildung des Osseus möglicherweise innerhalb eines Synzytium stattfindet. Basierend auf den erzielten Ergebnissen, wie dem Vorkommen von mRNA innerhalb des anosteocytischen Osseus, der Carboanhydraseaktivität, welche mit einem veränderten Knochenmineralsystem einhergeht, sowie zusätzlich das partielle Vorkommen einer Plasmamembran zwischen den spindelförmigen Osteozyten und dem Osseus, wurde ein neues Modell für die Intrazelluläre Knochenbildung bei höheren Fischen entwickelt.