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Doctoral Thesis
2010
Charakterisierung von Interaktionspartnern des Kernrezeptors CAR ("Constitutive Androstane Receptor") mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie
Charakterisierung von Interaktionspartnern des Kernrezeptors CAR ("Constitutive Androstane Receptor") mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie
Abstract (English)
The human nuclear receptor "constitutive androstane receptor" (CAR; NR1I3) plays a pivotal role in the induction of drug metabolism and transport by phenobarbital-type inducers. The hepatic expression of phase I and phase II drug metabolizing enzymes and of transporters is activated by CAR in response to structurally diverse chemicals. In addition to xenobiotic detoxification, activation of CAR is also involved in other hepatic functions like fatty acid oxidation, gluconeogenesis, clearance of steroid hormones and bilirubin. In primary hepatocytes, CAR resides predominantly in the cytoplasm associated with other proteins in a multimeric complex of which some components still remain to be identified. Upon exposure to inducers CAR dissociates from the already identified proteins of the complex, the cytosolic CAR retention protein (CCRP) and HSP 90 resulting in its translocation into the nucleus, where it heterodimerizes with the retinoid X receptor (RXR). The CAR-RXR heterodimer binds to its respective response elements in the regulatory region of target genes and recruits coactivators like SRC-1 (steroide receptor co-aktivator), GRIP1 (glutamate receptor interacting protein) and PGC 1 (peroxysom-proliferator-aktivated receptor γ co-activator 1) to induce gene transcription. To better understand the function of CAR, this study was focused on the identification of proteins which associate with CAR.
The aim of this work was to identify putative interaction partners of the nuclear receptor CAR which are expressed in liver to get additional information on structure and regulation of the native protein multimer complex und to obtain a better understanding of the functionality of CAR.
Hence, we have established an in vitro pulldown assay with liver homogenate to analyze protein-protein interactions of CAR. As a first step we generated GST and GST-CAR fusion proteins which were expressed in E. coli followed by affinity purification. Then we incubated the fusion proteins with total liver homogenate and separated bound proteins with SDS-PAGE. After visualization with silver staining, the protein bands were excised and prepared for mass spectrometry. For identification of new interaction partners of CAR in liver, the Matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF) was used.
After optimization of the pulldown assay we could identify several proteins like cytoskeletal proteins (e.g. lamin A), enzymes (e.g. pyruvate carboxylase, GAPDH) and chaperones (e.g. HSP 70) as binding to CAR.
As an especially interesting interaction partner of CAR we decided to further investigate the interaction of CAR with BRG1-associated factor (BAF) 155. This protein is a component of the mammalian SWI / SNF chromatin remodeling complex that plays an important role in fundamental cellular processes such as transcription, replication, and the repair of chromatin. Interaction of GST-CAR-LBD fusion protein was confirmed by additional methods like pulldown assay of GST-CAR with (35S)-methionine labeled BAF 155 in vitro and co-immunoprecipitation of the two proteins. Additionally, we could confirm BAF 155 interaction with CAR by Western blotting of the original pulldown samples. Analyzing the interaction of CAR and BAF 155 with RNA interference was not successful, since the method could not be optimized and validated appropriately, due to time constraints.
In conclusion, we were able to establish a highly reliable and reproducible assay to investigate protein interactions resulting in the significant identification of new interaction partners of CAR. Regarding the identified CAR interaction partner BAF 155, this protein or the complete SWI / SNF complex could play a functional role in CAR-mediated transcriptional activation, however further research is needed to establish the role of BAF 155 in CAR function.
Abstract (German)
Der konstititutive Androstanrezeptor (constitutive androstane receptor; CAR; NR1I3), ein Kernrezeptor, spielt eine entscheidende Rolle in der Induktion des Arzneimittelmetabolismus und -transports durch Aktivatoren vom Phenobarbital-Typ. Die hepatische Expression zahlreicher arzneimittelmetabolisiernder Enzyme der Phase I und Phase II sowie von Transportproteinen wird durch CAR als Antwort auf diverse Chemikalien induziert. Neben seiner Funktion in der Entgiftung von Fremdstoffen ist CAR auch involviert in andere hepatische Funktionen wie Fettsäureoxidation, Glukoneogenese und die Sekretion von Steroidhormonen und Bilirubin. In primären Hepatozyten ist CAR vorwiegend im Cytoplasma lokalisiert und mit anderen Proteinen in einem großen Multimerkomplex assoziiert, dessen Komponenten noch nicht vollständig identifiziert wurden. Durch Aktivatoren wie Phenobarbital dissoziiert CAR von bekannten Proteinen des Multimerkomplexes, dem cytosolischen CAR-Retentionsprotein (CCRP) und dem Chaperon HSP90. Dies führt nach Dephosphorylierung durch die Proteinphosphatase 2A (PP2A) zur Translokation in den Nukleus, wo CAR mit dem Retinoid-X-Rezeptor (RXR) heterodimerisiert. CAR-RXR bindet an die entsprechenden DNA-Bindungsstellen in der regulatorischen Region der Zielgene und rekrutiert Ko-Aktivatoren wie SRC-1 (Steroidrezeptor Ko-Aktivator), GRIP1 (Glutamatrezeptor interagierendes Protein) und PGC-1 (Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor γ Ko-Aktivator 1), um die Gentranskription zu induzieren.
Ziel dieser Arbeit war es, den in der Leber exprimierten Kernrezeptor CAR auf putative Interaktionspartner zu untersuchen, um eventuell Hinweise auf Aufbau und Regulation des nativen Proteinmultimerkomplexes zu erhalten und um die Funktion von CAR besser verstehen zu können.
Zu diesem Zweck wurde ein in vitro Pulldown-Assay mit Leberhomogenat zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen von CAR etabliert. Als ersten Schritt wurden GST und GST-CAR-LBD-Fusionsproteine generiert, die in E. coli Bakterienzellen exprimiert und anschließend affinitätsgereinigt wurden. Die Fusionsproteine wurden mit Leberhomogenat inkubiert und gebundene Proteine mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Nach Visualisierung mit Silbernitrat wurden die Proteinbanden ausgeschnitten und für die Massenspektrometrie präpariert. Neue Interaktionspartner von CAR wurden über die massenspektrometrische MALDI (Matrix assisted Laser Desorption/Ionisation)-Methode identifiziert.
Nach Optimierung der Pulldown-Methode wurden diverse Strukturproteine, Transportproteine und Enzyme signifikant als putative neue Interaktionspartner von CAR identifiziert, u.a. das Hitzeschockprotein 70, die Pyruvatcarboxylase, GAPDH, Carbonylreduktase, Lamin A, Phosphatidylinositol Transferprotein 1 und BAF 155 (BRG1-assoziierter Faktor).
Als besonders interessanter potenzieller Interaktionspartner von CAR wurde das Protein BAF 155 im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht. Dieses Protein ist Bestandteil eines Säuger-SWI / SNF Chromatin-?remodeling? Komplexes, der in fundamentalen zellulären Prozessen wie Transkription, Replikation und Reparatur von Chromatin eine wichtige Rolle spielt. Die Interaktion des GST-CAR Fusionsproteins mit BAF 155 wurde mit verschiedenen Methoden wie in vitro GST-Pulldown-Assay und in vivo Immunpräzipitation bestätigt. Im Western Blot wurde BAF 155 in den Pulldown-Proben mit Leberhomogenat ebenfalls nachgewiesen. Eine funktionelle Analyse der Interaktion mittels RNA-Interferenz war leider nicht erfolgreich, da die Methode aus Zeitgründen nicht mehr erfolgreich optimiert und validiert werden konnte. Zusammenfassend konnte der Pulldown-Assay, kombiniert mit massenspektrometrischen MALDI-TOF Analysen, als eine reproduzierbare Methode zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen etabliert werden und lieferte diverse neue putative Interaktionspartner von CAR. Das in dieser Arbeit identifizierte Protein BAF 155 bzw. der ganze SWI / SNF Komplex könnten eine wichtige Rolle in der CAR-induzierten transkriptionalen Aktivierung spielen.
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Faculty
Faculty of Natural Sciences
Institute
Institute of Nutritional Sciences
Examination date
2011-01-26
Supervisor
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ISBN
Language
German
Publisher
Publisher place
Classification (DDC)
570 Biology
Collections
Original object
Standardized keywords (GND)
Sustainable Development Goals
BibTeX
@phdthesis{Melgar2010,
url = {https://hohpublica.uni-hohenheim.de/handle/123456789/5455},
author = {Melgar, Clint},
title = {Charakterisierung von Interaktionspartnern des Kernrezeptors CAR ("Constitutive Androstane Receptor") mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie},
year = {2010},
school = {Universität Hohenheim},
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