Determination of organophosphorus and carbamate insecticides in food samples by high-performance thin-layer chromatography multi-enzyme inhibition assay

Abstract

In terms of effect-directed analysis, esterase inhibitor assays allow a rapid and selective detection of insecticidal organophosphates and carbamates in food and environmental samples. With consideration to the toxicological mechanism of action of these insecticides, cholinesterases of different origin were used in different test formats, as microtiterplate assays, in test strip formats, as biosensors or coupled to thin-layer chromatography (bio-autography). Instead of cholinesterases, Ingrid Walz (PhD thesis, University of Hohenheim, 2008) introduced rabbit liver esterase (RLE), Bacillus subtilis (BS2)-esterase and cutinase (CUT) from Fusarium solani pisi for a multi-enzyme microtiterplate assay. In particular, RLE and BS2 proved to be much more sensitive than chloinesterases for the detection of inhibitors, while CUT displayed oneself by special tolerance for matrix components from fruits. This multi-enzyme assay was successfully transferred onto high-performance thin-layer chromatography (HPTLC). With the insecticide examples of carbofuran, malaoxon and paraoxon as weak, medium and strong inhibitors, HPTLC-enzyme inhibition (HPTLC-EI) assay conditions were optimized concerning enzyme concentrations, incubation times and substrate reactions. In the presence of the substrate α-naphthyl acetate/Fast Blue Salt B leads to colourless inhibitor zones are obtained on a purple background, which can be sensitively quantified by scanning at 533 nm. The limits of detection for paraoxon were determined to 1.3, 1.2, and 540 pg/zone for RLE, BS2, and CUT, respectively. Malaoxon was detectable up to 7.9, 7.4 and 760 ng/zone, while the limits of detection for carbofuran were at 33, 54 and 1420 ng/zone.

Im Sinne einer wirkungsbezogenen Analytik erlauben Esterase-Hemmstoff-Assays einen schnellen und selektiven Nachweis von insektiziden Organophosphaten und Carbamaten in Lebensmitteln und Umweltproben. Mit Rücksicht auf den toxikologischen Wirkungsmechanismus dieser Insektizide kommen Cholinesterasen verschiedener Herkunft in diversen Testformaten zum Einsatz, als Küvetten-/Titerplatten-Assays, in Teststreifenformaten, als Biosensoren oder auch gekoppelt mit der Planarchromatographie (Bioautographie). Anstelle von Cholinesterasen führte Ingrid Walz (Dissertation Universität Hohenheim, 2008) Kaninchenleber-Esterase (RLE), Bacillus subtilis (BS2)-Esterase und Cutinase (CUT) aus Fusarium solani pisi für einen Multienzym-Titerplattenassay ein. Insbesondere RLE und BS2 erwiesen sich dabei als wesentlich empfindlicher als Chloinesterasen zum Nachweis von Hemmstoffen, während CUT sich durch besondere Toleranz gegenüber Matrixkomponenten aus Früchten auszeichnete. Dieser Multienzym-Assay wurde erfolgreich auf die Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (High-performance thin-layer chromatography, HPTLC) übertragen. Mit den Wirkstoffbeispielen Carbofuran, Malaoxon und Paraoxon als schwache, mittlere und starke Hemmstoffe wurden die Bedingungen für den HPTLC?Enzyme Inhibition (HPTLC?EI) Assay hinsichtlich Enzymkonzentrationen, Inkubationszeiten sowie Substratreaktionen optimiert. In Gegenwart des Substrates α-Naphthylacetat/Echtblausalz B kommt es zu farblosen Hemmstoffzonen auf einem violetten Hintergrund, die sich mittels Scan bei 533 nm empfindlich quantifizieren lassen. Die Nachweisgrenzen für Paraoxon wurden zu 1,3, 1,2, und 540 pg/Zone für die Enzyme RLE, BS2, und CUT bestimmt. Malaoxon war nachweisbar bis zu 7,9, 7,4 und 760 ng/Zone, während die Nachweisgrenzen für Carbofuran bei 33, 54 und 1420 ng/Zone lagen.