Molekulare Interaktionen von Milchsäurebakterien mit enterohämorrhagischen Escherichia coli und humanen Darmepithelzellen

Abstract

The interactions of 19 benign strains of lactic acid bacteria, bifidobacteria and staphylococci with five enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) strains of different serotypes and virulence gene spectrum were investigated using a HT29 cell culture infection model. As a parameter for the infection the secretion of Interleukin 8 (IL-8) of the infected cells was analyzed by ELISA. None of the used benign strains induced an IL-8 secretion, whereas the infection with the EHEC strains leads ? independent of their virulence profile - to high amounts of IL-8. In coinfection assays with the pathogen EDL933 (O157:H7) and different test strains the secretion of IL-8 of the cultured cells was decreased by a few strains. With 12 of 19 tested strains, a weak reduction < 30 % of IL-8 secretion of HT29 cells after coinfection with EHEC O157:H7 strain EDL933 was observed. Six strains reduced the IL-8 secretion up to 60 % and the strain B. breve DSMZ 20083 decreased the IL-8 production about 73 %. Coinfection assays with different strains of one species (B. adolescentis DSMZ 20083 and DSMZ 20086 as well as L. johnsonii BFE 633 and DSMZ 10533) showed the strain specificity of the observed anti-inflammatory effect, due to different capabilities of IL-8 reduction. In further coinfection assays with different EHEC strains of the serotypes O103:H2, O26:H-, 0157:H- and O113:H21 different abilities of the benign strains to influence the infection with the different pathogen strains were noted. Therefore the protective anti-inflammatory effect is strain specific for the tested benign bacteria and also depends on the application of EHEC strains with different sero- and virulence types. Further investigations indicated the imperative of living bacteria for the observed protective effect; neither culture supernatant nor inactivated bacteria showed an effect on the IL-8 secretion of the EDL933 infected HT29 cells. The analysis of the cell culture supernatants 6 h after infection with different bacteria detected the production of lactic and acetic acid. The application of these acids in infection assays with EDL933 did not lead to an reduced IL-8 secretion of the infected cells. Therefore the production of organic acids did not explain the protective effect. The induction of IL-8 could not be traced back to the influence of a single virulence factor. Four PMK5 strains with deletions in different virulence genes induced similar IL-8 secretions in comparison to cells infected with the wild-type strain. Coinfection assays with the mutants and S. pasteuri LTH 5211 showed also similar IL-8 reductions than coinfection assays with the wild-type strain. It is to suppose that the anti-inflammatory effects of the benign bacteria do not influence a single virulence factor of the tested EHEC strains. As a second parameter the activation of the transcription factor ?Nuclear Factor kappa B? (NF-&#954;B) of coinfected HT29 cells was monitored using a reporter-genassay. In comparison to the single EHEC-infection, the NF-&#954;B activation was reduced by all tested lactic acid bacteria, bifidobacteria and S. pasteuri LTH 5211 in coinfection trials significantly. No strain-specificity and no pathogen-specificity could be observed. Interestingly, stimulation of the HT29 cells with benign bacteria led to inhibition of NF-&#954;B activity, the measured values were less than the values of the negative control PBS. A gene expression analysis of toll-like receptors (TLRs), recognizing bacteria on cell surfaces and initiating the immune response, showed no regulation for TLR2. Infection with EDL933 led to down regulation of TLR4 and to up regulation of TLR9. Stimulation with L. rhamnosus GG, L. johnsonii DSMZ 10533 or L. fermentum DSMZ 20052 led neither to regulation of TLR4 nor TLR9. The benign bacteria did not influence the EHEC-induced TLR4 regulation in coinfection trials; in contrast the regulation of TLR9 was reduced significantly. The model described here is useful for screening basic effects of protective bacteria that are able to counteract EHEC-mediated effects on human cells and to study the molecular interaction between bacteria as well as between bacteria and human cultured cells.

Es wurden die Wechselwirkungen von potentiellen probiotischen Bakterienstämmen der Gattungen Bifidobacterium, Lactobacillus und Staphylococcus mit enterohämorrhagischen Escherichia coli (EHEC) im Zellkulturmodell (HT29-Zellen) untersucht. Es wurden 19 potentielle probiotische Stämme sowie fünf EHEC-Stämme mit verschiedenen Virulenzprofilen ausgewählt und Infektionsversuche durchgeführt. Keiner der potentiellen probiotischen Stämme zeigte eine Induktion der IL-8 Sekretion der infizierten Zellen, wohingegen alle EHEC-Stämme unabhängig von ihrem Virulenzprofil die Bildung von IL-8 in ähnlicher Menge induzierten. In Co-Infektionsversuchen mit E. coli O157:H7 Stamm EDL933 und den zu testenden benignen Bakterien wurden hemmende Effekte auf die IL-8 Sekretion der infizierten HT29-Zellen festgestellt. Von 19 untersuchten Stämmen zeigten 12 Stämme eine sehr geringe Absenkung der IL-8 Bildung der infizierten Zellen von < 30 %), sechs Stämme zeigten einen protektiven, anti-inflammatorischen Effekt auf die infizierten Epithelzellen, die IL-8 Produktion wurde um bis zu 60 % abgesenkt. Den stärksten Effekt zeigte B. breve DSMZ 20213 mit einer Absenkung der IL-8 Sekretion von 73 %. Bei der Durchführung von Co-Infektionsversuchen mit verschiedenen Stämmen einer Spezies (B. adolescentis DSMZ 20083 und DSMZ 20086 sowie L. johnsonii BFE 633 und DSMZ 10533) konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem beobachteten anti-inflammatorischen Effekt um einen Stamm-spezifischen Effekt handelt, da jeweils nur bestimmte Stämme einer Spezies diesen Effekt auslösen konnten. In nachfolgenden Co-Infektionsversuchen mit den zu testenden Bakterien und den weiteren vier EHEC-Stämmen unterschiedlicher Serotypen und Virulenzprofile, zeigte sich zudem ein Pathogen-spezifischer Effekt. Der gemessene anti-inflammatorischer Effekt variierte je nach eingesetztem pathogenen EHECStamm. In weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass der beobachtete antiinflammatorische Effekt nur mit lebenden Bakterien erzielt werden konnte. Weder der Kulturüberstand von lebenden Bakterien noch inaktivierte Bakterien konnten einen Effekt auf die IL-8 Sekretion der mit EDL933 infizierten Zellen hervorrufen. Mittels High Performance Liquid Chromatography (HPLC) wurden in den Überständen der Zellkulturen 6 h nach erfolgter Infektion Milchsäure und Essigsäure detektiert. Der Einsatz dieser organischen Säuren in Infektionsversuchen mit EDL933 im Zellkulturmodell zeigte jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die IL-8 Sekretion der infizierten Zellen. Der protektive anti-inflammatorische Effekt kann somit nicht mit dem Einfluss gebildeter Säuren begründet werden. Die Induktion der IL-8 Sekretion konnte ebenfalls nicht auf einen einzelnen Virulenzfaktor zurückgeführt werden. In Infektionsversuchen mit vier Deletionsmutanten des Stammes PMK5, bei denen jeweils eines der Virulenzgene ausgeschaltet war, wurden im Vergleich zur Infektion mit dem Wildtyp-Stamm ähnliche IL-8 Sekretionen der HT29-Zellen gemessen. In Co-Infektionsversuchen mit S. pasteuri LTH 5211 und den vier Deletionsmutanten zeigten sich im Vergleich zu dem Co-Infektionsversuch mit dem Wildtyp Stamm ähnliche IL-8 Reduktionen, so dass davon auszugehen ist, dass S. pasteuri LTH 5211 die IL-8 Sekretion der mit PMK5 infizierten HT29-Zellen nicht auf der Beeinflussung eines einzelnen Pathogenitätsfaktors beruht. Die Untersuchung der Aktivierung des der IL-8 Produktion vorgeschalteten Transkriptionsfaktors?Nuklearer Faktor-kappa B? (NF-&#954;B) in HT29-Zellen ergab für Co-Infektionsversuche eine deutlich niedrige Aktivität, als die reine EHEC-Infektion. Dies bestätigt die Ergebnisse der IL-8 Messungen, wobei weder eine Stamm- noch eine Pathogenspezifität festgestellt werden konnte. Zellstimulationen mit den potentiellen probiotischen Bakterien alleine führten zu einer Hemmung der NF-&#954;B-Aktivität, da die gemessenen Werte niedriger als die Negativkontrolle ausfielen. Eine Genexpressionsanalyse von Toll-like-Rezeptoren, welche Bakterien auf der Zelloberfläche erkennen und die Immunantwort initiieren, zeigte für den TLR2 in dem verwendeten Zellkulturmodell keine Regulation. Die Infektion mit EDL933 reguliert den TLR4 herunter und den TLR9 hinauf. In Co-Infektionsversuchen mit L. rhamnosus GG, L. johnsonii DSMZ 10533 oder L. fermentum DSMZ 20052 und EDL933 konnte kein Einfluss auf die von EDL933 ausgelöste Regulierung des TLR4 festgestellt werden. Die durch die EHEC-Infektion ausgelösten Genexpression von TLR9 hingegen wurde durch die Co-Infektion signifikant reduziert. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass es möglich ist im Zellkulturmodell protektive Effekte von Probiotika auf die Infektion mit EHEC zu messen.