Adaptations of Prevotella bryantii B14 to short-chain fatty acids and monensin exposure

Abstract

The rumen microbiome constitutes a complex ecosystem including a vast diversity of organisms that produce and consume short-chain fatty acids (SCFAs). It is of great interest to analyze these activities as they are of benefit for both, the microbiome and the host. This dissertation aims to display the proteome and metabolome of the predominant ruminal representative Prevotella bryantii B14 in presence of various SCFA and under exposure of the antibiotic monensin in pure and mixed culture (in vitro). Due to the strong contributing abundance of Prevotellaceae in the rumen microbiome, the representative P. bryantii B14 (DSM 11371) was chosen to investigate biochemical factors for the success of withstanding monensin and the impact of SCFA on their growth. The current work is composed of two effective publications. The formatting was aligned to the dissertation. The first publication, studying the supplementation of various SCFAs, showed SCFAs as growth promoting but not essential for P. bryantii B14. Pure cultures of P. bryantii B14 were grown in Hungate tubes under anaerobic conditions. Gas chromatography time of flight mass spectrometry (GC-ToF MS) was used to quantify long-chain fatty acid (LCFA) profiles of P. bryantii B14. Proteins of P. bryantii B14 were identified and quantified by using a mass spectrometry-based, label-free approach. Different growth behavior was observed depending on the supplemented SCFA. An implementation of SCFAs on LCFAs and the composition on membrane proteins became evident. Supplementing P. bryantii B14 with branched-chain fatty acids (BCFAs), in particular isovaleric acid, showed an increase of the 3-IPM pathway, which is part of the branched-chain amino acid (BCAA) metabolism. Findings point out that the structure similarity of isovaleric acid and valine is most likely enhancing the conversion of BCFA into BCAA. The required set of enzymes of the BCAA metabolism supported this perspective. The ionophore monensin has antibiotic properties which are used in cattle fattening but also for treating ketosis and acidosis in ruminants. In the second publication, P. bryantii B14 was exposed to different concentrations of monensin (0, 10, 20 and 50 uM) and to different exposure times (9, 24, 48 and 72 h) with and without monensin. Growth behavior, glucose and intracellular sodium concentration were determined. Proteins were analyzed by label-free quantification method using the same method as in the previous mentioned experiment. Fluorescence microscopy was used to observe extracellular polysaccharides (EPS) of P. bryantii B14. A progressing monensin exposure triggered disconnection between P. bryantii B14 cells to the sacrificial EPS layer by increasing its number and amount of carbohydrate active enzymes (CAZymes). Simultaneously, an increase of extracellular glucose was monitored. Reduction of intracellular sodium was likely to be performed by increasing the abundance of ion-transporters and an increased activity of Na+-translocating NADH:quinone oxidoreductase under monensin supplementation. The role of monensin supplemented Prevotella in a mixed culture of the rumen microbiome was described. Extracted rumen fluid from cows was incubated anaerobically by using the rumen simulation technique (Rusitec). Proteomics of the solid phase was applied by using a similar approach as in the previous related studies. Metabolomics of the liquid phase from the Rusitec content was performed by using 1H-nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Further parameters such as pH, gas and methane production were monitored over time. The experiment was constituted out of three phases starting with an adaptation phase of 7 days. A subsequent treatment phase followed, where monensin was supplemented via the daily introduced total mixed ration (TMR) for further 7 days. The elution phase was the final phase when monensin supplementation was stopped and monitoring was continued for further 3 days. Metabolomics and proteomics showed that members of the genus Prevotella remained most abundant under monensin supplementation. Furthermore, shifting the ruminal metabolism to an increased production of propionate by shifting the metabolism of Prevotella sp. to an enhanced succinate production. The current work shows the impact of SCFAs on various metabolic functions of P. bryantii B14. Diverse defence mechanisms of Prevotella sp., in particular P. bryantii B14, were shown to avoid the antibiotic effects of monensin.

Das Pansenmikrobiom ist ein komplexes Ökosystem mit einer großen Vielfalt an Organismen, die kurzkettige Fettsäuren (SCFAs) produzieren und verbrauchen. Es ist von großem Interesse, diese Aktivitäten zu analysieren, da sie sowohl für das Mikrobiom als auch für den Wirt von Nutzen sind. Ziel dieser Arbeit ist es, das Proteom und Metabolom des vorherrschenden Pansenvertreters Prevotella bryantii B14 in Gegenwart verschiedener SCFA und unter Einwirkung des Antibiotikums Monensin in Rein- und Mischkultur (in vitro) darzustellen. Aufgrund der großen Anzahl von Prevotellaceae im Pansenmikrobiom wurde der Vertreter P. bryantii B14 (DSM 11371) ausgewählt, um die biochemischen Faktoren für die erfolgreiche Resistenz gegenüber Monensin und die Auswirkungen von kurzkettigen Fettsäuren auf ihr Wachstum zu untersuchen. Die aktuelle Arbeit besteht aus zwei Publikationen [1, 2], die in Kapitel 2 und 3 eingefügt sind, sowie einem eingereichten Manuskript in Kapitel 4. Die Formatierung der Publikationen und des Manuskriptes wurde an die Dissertation angepasst. Die erste Veröffentlichung (Kapitel 2) befasste sich mit der Supplementierung verschiedener SCFAs und zeigt, dass SCFAs wachstumsfördernd, aber nicht essentiell für P. bryantii B14 sind. Reinkulturen von P. bryantii B14 sind in Hungate-Röhrchen unter anaeroben Bedingungen durchgeführt worden. Gaschromatographie-Flugzeit-Massen-spektrometrie (GC-ToF MS) wurde zur Quantifizierung der langkettigen Fettsäuren (LCFA) von P. bryantii B14 verwendet. Die nicht-markierte und nicht-angereicherte Proteine von P. bryantii B14 wurden mit Hilfe von Massenspektrometrie identifiziert und quantifiziert. Es wurde ein unterschiedliches Wachstumsverhalten in Abhängigkeit von der zugeführten SCFA beobachtet. Eine Auswirkung der strukturellen Eigenschaften der SCFAs hat sich auf die LCFAs und ebenso auf die Anwesenheit verschiedener Membranproteine bemerkbar gemacht. Die Supplementierung von P. bryantii B14 mit verzweigtkettigen Fettsäuren (BCFAs), insbesondere Isovaleriansäure, hat einen Anstieg des Stoffwechsels von 3-Isopropylmalat (IPM) gezeigt, welcher Teil des Stoffwechsels von verzweigtkettigen Aminosäuren (BCAAs) ist. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Strukturähnlichkeit von Isovaleriansäure und Valin höchstwahrscheinlich die Umwandlung von BCFA in BCAA begünstigt. Der relative Anstieg der erforderlichen Enzyme BCAA-Stoffwechsel unterstützen diese Sichtweise. Das Ionophor Monensin hat antibiotische Eigenschaften, welche in der Rindermast, aber auch zur Behandlung von Ketose und Azidose bei Wiederkäuern eingesetzt wird. Die zweiten Veröffentlichung (Kapitel 3) zeigte den Einfluss verschiedenen Konzentrationen von Monensin (0, 10, 20 und 50 μM) und verschiedenen Expositionszeiten (9, 24, 48 und 72 h) mit und ohne Monensin auf P. bryantii B14. Das Wachstumsverhalten, extrazelluläre Glukose- und intrazelluläre Natriumkonzentration wurde unter den beschriebenen Bedingungen ermittelt. Das Proteom von P. bryantii B14 wurde mittels markierungsfreier Quantifizierung nach der gleichen Methode wie in Kapitel 2 analysiert. Fluoreszenzmikroskopie wurde zur Unter-suchung der extrazellulären Polysaccharide (EPS) von P. bryantii B14 eingesetzt. Mit fortschreitender Monensin-Exposition hat sich gezeigt, dass P. bryantii B14 die Verbindung zur äußeren EPS abbaute, indem es die Anzahl und Menge der kohlenhydrataktiven Enzyme (CAZyme) erhöhte. Der Anstieg an extrazellulärer Glukose bestätigte die Vermutung, dass die „Opferschicht“ abgebaut wurde. Die beobachtete Reduktion des intrazellulären Natriums ist wahrscheinlich mit der Zunahme der Menge an Ionentransportern verbunden. Weiterhin wurde eine erhöhte Aktivität der Na+-transferrierenden NADH:Quinon-Oxidoreduktase (NQR) unter Monensin-Supplementierung dokumentiert. Die Rolle von mit Monensin supplementierten Prevotella in einer Mischkultur des Pansenmikrobioms ist im letzten Manuskript beschrieben worden (Kapitel 4). Pansensaft ist mit Hilfe der Pansensimulationstechnik (Rumen simulation technique = Rusitec) anaerob inkubiert worden. Das Proteom der festen Phase ist mit einem ähnlichen Ansatz wie in Kapitel 2 und 3 durchgeführt worden. Das Metabolom der flüssigen Phase aus dem Rusitec ist anhand der 1H-Kernresonanz (Nuclear magnetic resonance = NMR) spektroskopie ermittelt worden. Weitere Parameter wie pH-Wert, Gas- und Methan-produktion wurden im Zeitverlauf überwacht. Das Experiment bestand aus drei Phasen, beginnend mit einer Anpassungsphase von 7 Tagen. Es folgte eine Behandlungsphase, in der Monensin über das tägliche verabreichen der totalen Mischration (TMR) für weitere 7 Tage durchgeführt wurde. Die Elutionsphase war die letzte Phase, in der die Monensinzugabe eingestellt und die Überwachung für weitere 3 Tage fortgesetzt wurde. Metabolomics und Proteomics haben gezeigt, dass Mitglieder der Gattung Prevotella unter Monensinzugabe am häufigsten vorkommen. Außerdem verlagerte sich der Pansenstoffwechsel auf eine erhöhte Propionatproduktion. Der Stoffwechsel von Prevotella sp. wurde auf eine erhöhte Succinat-produktion umgestellt. Die vorliegende Arbeit zeigt die Auswirkungen von SCFAs auf verschiedene Stoffwechselfunktionen von P. bryantii B14. Es wurde gezeigt, dass verschiedene Abwehrmechanismen von Prevotella sp. und insbesondere von P. bryantii B14 die anti-biotische Wirkung von Monensin verhindern.