Charakterisierung der lichtinduzierten Internalisierung des Ionenkanals TRPL aus Drosophila melanogaster

Abstract

The light-dependent isomerization of rhodopsin (Rh1), which takes place in the compound eyes of Drosophila, leads to the activation of the visual signaling cascade. The result is a depolarizing receptor potential caused by the Ca2+-influx through the two cation channels TRP and TRPL. This Ca2+ influx subsequently mediates a change in the subcellular localization of the TRPL channel by inducing its translocation. TRPL of dark-adapted flies is located inside the rhabdomeres, whereas upon illumination, TRPL translocates to a yet unidentified storage compartment in the cell body of the photoreceptor cell. The translocation is reversible; however, the underlying mechanism remains largely unclear. Based on the observation of TRPL-containing vesicles on immunocytochemical sections of illuminated flies a vesicular transport mechanism has been proposed for TRPL translocation. In the present work, the mechanism underlying light-dependent TRPL internalization was studied. Using immunocytochemical techniques, a co-localization of rhodopsin and TRPL was observed in endocytic vesicles. Like many other G-protein coupled receptors, Rhodopsin undergoes endocytosis following activation. The rate of Rh1 internalization depends on the amount of metarhodopsin and, therefore, on the light quality used for illumination. The internalization rate was determined by counting Rh1- and TRPL-positive vesicles observed upon illumination with different light qualities. Surprisingly, the light quality that induced the highest number of Rh1-positive vesicles (i.e. blue light) caused the lowest number of TRPL-positive vesicles, while illumination with orange light induced strong TRPL internalization, but poor Rh1 endocytosis. Likewise, time courses of TRPL internalization were significantly faster in orange light compared to blue light. These findings may indicate a competition between TRPL and Rh1 for a common internalization factor. Analysis of endocytosis in different mutants showed that the internalization of TRPL required Ca2+ influx mediated by the activation of the phototransduction cascade, whereas internalization of Rhodopsin was Ca2+-independent. Therefore, the trigger for activating TRPL and Rh1 endocytosis seems to be different, although both types of internalization were mechanistically similar and depended on dynamin function. The internalization of Rhodopsin is mediated by Rab5. A screen of dominant negative Rab mutants revealed that the light-induced internalization of TRPL is mediated by Rab5 and RabX4. Accordingly, the involvement of Rab5 constitutes another common feature in the endocytosis of TRPL and Rh1. Arrestins play an important role in regulating the endocytosis of rhodopsin. Whereas arrestin2 mediates the inactivation of metarhodopsin, arrestin1 is responsible for subsequent rhodopsin endocytosis. The endocytosis of TRPL is independent of arrestins, but arrestin2 fulfills an important function regarding the stability of the TRPL protein in the rhabdomere. In the present work, the analysis of different arr2 alleles revealed a complete degradation of the TRPL protein after ten days in darkness, but not in light. This finding suggests that arrestin2 has a possible function as a scaffolding protein in the rhabdomer of dark-adapted flies, but not of light-adapted flies, when TRPL is located in a storage compartment in the cell body. There is another fundamental difference between the two transport mechanisms regarding the fate of the protein after it has been internalized. Rhodopsin undergoes rapid lysosomal degradation whereas the trafficking of TRPL is described as a recycling mechanism. In this work, it was possible to show colocalization of TRPL with recycling endosomes indicating an involvement of these compartments in TRPL trafficking. Furthermore, rhodopsin but not TRPL showed colocalization with a lysosomal marker in light-adapted flies, providing additional evidence for the recycling of the TRPL channel.

Die lichtinduzierte Isomerisierung von Rhodopsin in den Komplexaugen von Drosophila führt zur Aktivierung der visuellen Signalkaskade. Der daraus resultierende Kationen-Einstrom durch die beiden Kanäle TRP und TRPL führt letztlich zur Ausbildung eines depolarisierenden Rezeptorpotentials. Darüber hinaus induziert der lichtabhängige Ca2+- Einstrom eine Änderung der subzellulären Lokalisation des TRPL-Kanals. In dunkeladaptierten Fliegen befindet sich der TRPL-Kanal innerhalb der Rhabdomere, während er in helladaptierten Fliegen in einem unbekannten Speicherkompartiment im Zellkörper der Photorezeptorzelle lokalisiert ist. Die lichtabhängige Translokation des TRPL-Kanals ist reversibel. Der Mechanismus dieses lichtinduzierten Transports ist noch weitestgehend ungeklärt, allerdings legen Beobachtungen von vesikulären Strukturen auf immunzytochemischen Schnitten belichteter Fliegen eine Vesikel-vermittelte Endozytose nahe. In der vorliegenden Arbeit wurde der Mechanismus der lichtinduzierten Internalisierung des TRPL-Kanals charakterisiert. Anhand immunzytochemischer Studien wurde gezeigt, dass die bei Belichtung gebildeten vesikulären Strukturen nicht nur TRPL sondern darüber hinaus auch Rhodopsin (Rh1) enthalten. Rhodopsin wird wie viele G-Protein-gekoppelte Rezeptoren nach Aktivierung internalisiert. Da bei verschiedenen Wellenlängen unterschiedliche Mengen an aktiviertem Rhodopsin (Metarhodopsin) gebildet werden, hängt die Endozytoserate von Rhodopsin maßgeblich von der Wellenlänge des verwendeten Lichts ab. Um die Endozytoserate von Rh1 aber auch von TRPL quantitativ zu erfassen, wurde die Anzahl der gebildeten Vesikel bei verschiedenen Lichtqualitäten bestimmt. Dabei zeigte sich, dass TRPL bei einer hohen Rh1-Endozytoserate (induziert durch Blaulicht) kaum internalisiert wird, wohingegen Orangebelichtung zu einer starken TRPL-Endozytoserate bei geringer Rh1-Internalisierung führt. Die unterschiedlichen Endozytoseraten von TRPL bei verschiedenen Lichtqualitäten spiegelten sich auch in der Kinetik der TRPL-Translokation wider, was durch die Quantifizierung von Zeitverläufen belegt werden konnte. Diese Ergebnisse legen eine Kompetition zwischen Rh1 und TRPL bezüglich ihrer Internalisierung nahe, deren Ursache in einer Konkurrenz um einen gemeinsamen Internalisierungsfaktor begründet sein könnte. Durch Analyse der Endozytose in verschiedenen Mutanten konnte überdies gezeigt werden, dass die Endozytose von TRPL zwingend der Aktivierung der Signalkaskade bzw. des damit einhergehenden Ca2+-Einstroms bedarf, während die Internalisierung von Rhodopsin auch in Abwesenheit von Ca2+ erfolgt. Die Internalisierung von Rh1 und TRPL scheint folglich durch unterschiedliche Mechanismen aktiviert zu werden. Allerdings stellte sich heraus, dass die letztendliche Abschnürung von TRPL-enthaltenden endozytotischen Vesikeln, analog zur Internalisierung von Rh1, ein Dynamin-abhängiger Prozess ist. Die Endozytose von Rh1 wird durch das monomere G-Protein Rab5 vermittelt. Durch einen Screen dominant-negativer Rab-Mutanten konnte gezeigt werden, dass die lichtinduzierte Endozytose von TRPL durch die beiden Proteine Rab5 und RabX4 vermittelt wird. Somit stellt die Beteiligung von Rab5 an der Internalisierung beider Proteine eine weitere Gemeinsamkeit dar. Arrestine spielen bei der Endozytose von Rh1 eine wichtige Rolle. Während Arrestin2 die Inaktivierung des Metarhodopsins vermittelt, leitet Arrestin1 anschließend dessen Internalisierung ein. Dies gilt jedoch nicht für die Internalisierung des TRPL-Kanals. Arrestin2 besitzt im Fall von TRPL jedoch eine wichtige Funktion in Bezug auf dessen Stabilität im Rhabdomer. In der vorliegenden Arbeit wurde durch Analyse verschiedener arr2-Allele belegt, dass der TRPL-Kanal im Dunkeln innerhalb von 10 Tagen vollständig abgebaut wird, während er im Licht stabil bleibt. Folglich vermittelt Arr2 möglicherweise die Verankerung von TRPL im Rhabdomer in Dunkelheit, wohingegen es keine Bedeutung für die Stabilität des im Zellkörper lokalisierten TRPLs besitzt. Die Internalisierung von Rh1 und TRPL unterscheidet sich auch im Schicksal des internalisierten Proteins. Während endozytiertes Rhodopsin letztendlich einem lysosomalen Abbau unterliegt, wird im Fall des TRPL-Kanals von einem Recylingprozess ausgegangen. In dieser Arbeit gelang es, Kolokalisationen zwischen TRPL und einem Marker für Recyclingendosomen in helladaptierten Fliegen nachzuweisen, was eine Beteiligung dieser Kompartimente am TRPL-Transport nahelegt. Unter Verwendung eines Lysosomenmarkers gelang es überdies zu demonstrieren, dass internalisiertes TRPL, im Gegensatz zu Rhodopsin1, nicht mit Lysosomen kolokalisiert, was die Existenz eines Recylingprozesses unterstreicht.