The porcine intestinal microbiota : studies on diversity and dietary impact

Abstract

The entirety of microbial communities within the gastrointestinal tract is referred to as intestinal microbiota and is predominantly composed of bacteria. Interactions between the microbiota, the host and the diet are essential for maintaining a healthy and functional intestinal ecosystem. The overarching aim of this thesis was the characterization of the porcine intestinal microbiota and further to enhance knowledge about the effects of varying diets. High-throughput sequencing of the 16S rRNA gene facilitates exploration of the taxonomic composition of the microbiota. However, the respective findings may be impaired by methodological variations. Thus, within this thesis, commercial DNA extraction kits are evaluated for their suitability in porcine microbiota analysis. The tested extractions yield into variations of quantity and quality of DNA. The DNA extracts are further used to elucidate the structure of the microbiota by a rapid fingerprinting (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) and high-resolution sequencing (Illumina amplicon sequencing). While different variable regions of the 16S rRNA gene vary in the taxonomical resolution, sequencing analyses exhibit a good comparability of the two regions V1-V2 and the V5-V6. Furthermore, the microbiota profiles reveal a high consistency by the fingerprinting and sequencing approach but are distinguished by the different DNA extraction kits. Based on criteria of DNA extraction and the depicted microbiota composition, it is recommended to use the FastDNA SPIN Kit for Soil for further analysis of porcine intestinal microbiota. Subsequently, these methodological findings are applied to investigate the impact of varying diets. Illumina amplicon sequencing of the V1-V2 region of the 16S rRNA gene reveals different microbiota structures when diets are solely composed of rye or triticale. Besides the taxonomic analyses of ileal digesta and fecal samples, the concentrations of bacterial metabolites in feces are determined. In summary, rye promotes an increased abundance of saccharolytic bacteria like Lactobacillus, Bifidobacterium, and Prevotella and results in higher concentrations of bacterial metabolites in fecal samples. In contrast, a diet based on triticale is associated with an increased abundance of Clostridium sensu stricto, which may indicate an enhanced cellulolytic potential of the microbiota. When the crude protein content is increased (18%), compared to a lower content (14%), an increased abundance of Lactobacillus is demonstrated in microbiota of ileal digesta samples. However, the content of crude protein did not affect the overall microbiota significantly. In addition, dietary supplementation with probiotic Bacillus spp. shows no effect. In conclusion, these dietary effects on microbiota are considered together with results of a protein digestibility analysis. Moreover, an impact of dietary calcium and phosphorus in combination with different sources of dietary protein is analyzed by fingerprinting approach of digesta samples. Here, the content of calcium-phosphorus shows significant effects on the microbiota of caecal digesta and the putative identities of discriminative variables are determined by a cloning-sequencing approach. Similar, 16S rRNA gene sequencing reveals a significant impact of dietary calcium-phosphorus on the overall fecal microbiota without indicating specific discriminating variables. In combination with the results of a meta-proteomic approach, a gradual adaptation on dietary changes is indicated and consequently, a prolonged adaptation time of three to four weeks is recommended for diet-microbiota studies. This thesis includes a comprehensive analysis of the microbiota across and along the gastrointestinal tract of piglets and explores the dietary inclusion of four levels of insect larvae meal. Feeding insects represent an alternative source of dietary protein, whereby the increased content of chitin indicates a potential shift in microbiota composition compared to a control diet. However, in this case, the structural analysis demonstrates no effects on the overall microbiota’s structure. However, a pairwise comparison between diets reveals significant effects on the microbiota of digesta samples of the small intestine. Dietary inclusion of 5% insect meal increases the abundance of Lactobacillus, whereas the control treatment promotes Bifidobacterium. In conclusion, the results of the present thesis emphasize the importance of standardization within 16S rRNA gene based studies of the porcine intestinal microbiota. Furthermore, the necessity of studying various sampling sites combined with multidisciplinary approaches is demonstrated.

Die Gesamtheit der mikrobiellen Gemeinschaften im Gastrointestinaltrakt wird als intestinale Mikrobiota bezeichnet und setzt sich vorwiegend aus Bakterien zusammen. Wechselwirkungen zwischen der Mikrobiota, dem Wirt und der Ernährung sind unerlässlich für ein gesundes und funktionelles Ökosystem im Darm. Das übergeordnete Ziel dieser Thesis war die Charakterisierung der intestinalen Mikrobiota des Schweines und Kenntnisse über die Auswirkungen unterschiedlicher Diäten zu erweitern. Hochdurchsatz-Sequenzierung des 16S rRNA Gens erleichtert die Erforschung der taxonomischen Zusammensetzung der Mikrobiota. Allerdings können die jeweiligen Ergebnisse durch methodische Abweichungen beeinträchtigt sein. Aufgrund dessen werden im Rahmen dieser Thesis kommerzielle DNA Extraktions-Kits für ihre Eignung in der Analyse der Schweine-Mikrobiota bewertet. Die getesteten Extraktionen bringen Unterschiede in der DNA Quantität und Qualität hervor. Im Weiteren wird die DNA zur Aufklärung der Mikrobiota-Struktur, durch eine schnelle Fingerprinting-Methode (Terminales Restriktionsfragmentlängen-polymorphismus) und einem hochauflösenden Sequenzierungsansatz (Illumina Amplikon Sequenzierung), eingesetzt. Zwar variieren unterschiedliche variable Regionen des 16S rRNA Gens in der taxonomischen Auflösung, doch belegen Sequenzierungsanalysen eine gute Vergleichbarkeit von V1-V2 und V5-V6. Des Weiteren offenbaren die Mikrobiota-Profile eine hohe Übereinstimmung zwischen Fingerprinting und Sequenzierung, unterscheiden sich aber zwischen den unterschiedlichen DNA Extraktions-Kits. Basierend auf Kriterien der DNA Extraktion und der aufgeklärten Mikrobiota-Zusammensetzung, wird das FastDNA SPIN Kit for Soil für weitere Analysen der intestinalen Mikrobiota des Schweines empfohlen. Diese methodischen Erkenntnisse werden anschließend angewendet, um die Auswirkungen durch verschiedene Diäten zu untersuchen. So zeigt Illumina Amplikon Sequenzierung der V1-V2 Region des 16S rRNA Gens unterschiedliche Mikrobiotastrukturen auf, wenn Diäten sich nur aus Roggen oder Triticale zusammensetzen. Neben der taxonomischen Analyse von Chymusproben aus dem Ileum und dem Kot, werden auch Konzentrationen von bakteriellen Metaboliten bestimmt. Zusammenfassend fördert Roggen eine erhöhte Abundanz von saccharolytischen Bakterien wie Lactobacillus, Bifidobacterium und Prevotella und führt zu höheren Konzentrationen von bakteriellen Metaboliten im Kot. Im Gegensatz dazu ist eine Triticale-Diät mit einer erhöhten Abundanz von Clostridium sensu stricto assoziert, was ein erhöhtes cellulolytisches Potential der Mikrobiota andeutet. Bei einem erhöhtem Rohproteingehalt (18%) in der Diät, im Vergleich zu einem geringeren Gehalt (14%), wird eine erhöhte Lactobacillus-Abundanz im Chymus des Ileums aufgezeigt. Der Gehalt des Rohproteins beeinflusst allerdings die Gesamtheit der Mikrobiota nicht signifikant. Auch zeigt die diätische Ergänzung von probiotischen Bacillus spp. keinen Effekt. Abschließend werden diese diätischen Effekte auf die Mikrobiota gemeinsam mit den Ergebnissen der Proteinverdaulichkeitsanalyse betrachtet. Im Weiteren wird, anhand eines Fingerprinting-Ansatzes, ein Einfluss von Calcium und Phosphat in Kombination mit verschiedenen Proteinquellen in Chymusproben untersucht. Hier zeigt der Calcium-Phosphat Gehalt einen signifikanten Effekt auf die Mikrobiota im Chymus des Blinddarms. Die dafür verantwortlichen Bakterien werden durch einen Klonierung-Sequenzierung-Ansatz identifiziert. Ähnlich hierzu, weist die 16S rRNA Gen Sequenzierung von Kotproben einen signifikanten Einfluss des diätischen Calcium-Phosphors auf, ohne dabei auf bestimmte beeinflusste Bakterien hin zu deuten. Gemeinsam mit Ergebnissen eines Meta-Proteomik Ansatzes wird auf eine graduelle Anpassung an diätische Veränderungen hingewiesen und daher wird eine verlängerte Adaptationszeit von drei bis vier Wochen für Diät-Mikrobiota Studien empfohlen. Diese Thesis enthält auch eine umfassende Analyse der Mikrobiota quer durch und entlang des Gastrointestinaltraktes von Ferkeln und untersucht hier vier verschiedene Stufen einer Rationszulage von Insektenlarvenmehl. Die Verfütterung von Insekten stellt eine alternative Quelle von Protein dar, wobei, im Vergleich zu einer Kontrolldiät, der erhöhte Chitingehalt auf eine potentielle Veränderung der Mikrobiota hinweist. Hier zeigt allerdings nur ein paarweiser Vergleich zwischen den Diäten einen signifikanten Einfluss auf die Mikrobiota in Chymus Proben aus dem Dünndarm. Diätische Zulage von 5% Insektenmehl erhöht die Abundanz von Lactobacillus, wohingegen die Kontrollgruppe Bifidobacterium fördert. Abschließend heben die Ergebnisse dieser Thesis die Bedeutung einer Standardisierung innerhalb 16S rRNA Gen basierten Studien der intestinalen Mikrobiota des Schweines hervor. Des Weiteren wird die Notwendigkeit der Untersuchung verschiedener Probenentnahmestellen zusammen mit dem Einsatz von interdisziplinären Ansätzen aufgezeigt.