Untersuchung einer Methode zur spezifischen Fluoreszenz – Markierung von Signalproteinen und deren Beobachtung in lebenden Escherichia coli (Einzelmolekültechnik & Perspektiven)

Abstract

Malfunctions in signal transduction often cause diseases such as cancer and metabolic disorders. A thorough understanding of the relevant mechanisms of signal transduction is therefore an important requirement for the development of therapies and pharmaceuticals. In this thesis, a method was developed, which allows the observation of individual signaling proteins and their interactions in living cells. Therefore this method has advantages compared to molecular detection methods which are based on ensemble averages. As a model system for signal transduction, the bacterial chemotaxis with its regulator protein CheY was selected. The experimental studies were carried out with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), which requires a fluorescent labeling of the examined molecules. To ensure a specific and background reduced labeling, bright and photostable fluorescent ,tags are needed. In this work, the SNAP-tag system was used, which allows the use of different dyes. An advantage of this system is the possibility of using fluorescence-quenched benzyl guanine (BG)-dyes, which show a strong fluorescence only after binding to SNAP-tag. For development of the labeling method, the dyes Atto 620, Atto 633, Atto 655 and Atto 680 were analyzed in preliminary experiments regarding their fluorescence, photostability and blinking behavior. The thorough knowledge of these properties is essential for the correct interpretation of the experimental results. Dyes which are ideal for the method have a high fluorescent signal over a long observation time, and they are stable and do not interfere with the function of the target molecule. The preliminary investigations have shown that among the dyes tested, Atto 633 had the best photophysical properties for labeling with the SNAP-tag system and also the best cell permeability. This allows, under continuous laser excitation, to observe individual molecules for several seconds. In addition, the labeling efficiency was controlled by the protein expression, the dye concentration, and the incubation time of the dye. For single-molecule detection, a low labeling efficiency is of advantage since too high density of fluorescently labeled molecules makes the identification of individual molecules difficult. Subsequently, a labeling protocol was established which allows a specific, background- reduced fluorescence labeling of individual CheY proteins in living E. coli cells, without impairment of the protein’s functionality. Real-time detection with a time resolution of 30 milliseconds showed that it is possible to observe individual CheY molecules as a fluorescent point during the state of binding to an interaction partner. By means of numerical methods, the state of binding can be extracted from the fluorescence intensity traces as on/ off and their probability distribution can be determined. These quantitative studies gave indications on specific protein interactions, but no detailed information on binding times could be found. Different interactions of the protein, both specific and non-specific nature, could be the reason. Therefore, another important development of this labeling system would be the opportunity of simultaneous staining of two or more proteins with spectroscopically distinguishable fluorescent tags (e.g. CLIP-tag) to perform colocalization with alternating laser excitation. Another cause might be found in the nature of the dye itself. Laser- and temperature-dependent studies could provide further information concerning the behavior of the dyes. Thus, the described fluorescence labeling method provides a new approach for quantitative studies of protein interactions in living cells.

Störungen in der Signaltransduktion sind häufig die Ursache für Erkrankungen wie Krebs und Stoffwechselstörungen. Ein detailliertes Verständnis der relevanten Mecha-nismen der Signalübermittlung ist daher eine wichtige Voraussetzung für die Entwick-lung von Therapien und die Herstellung von Medikamenten. In dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die es erlaubt einzelne Signalproteine und deren Interaktionen in der lebenden Zelle zu beobachten, im Gegensatz zu molekularbiologischen Nachweis-verfahren, welche auf Ensemblemittelwerten beruhen. Als Modellsystem für die Signal-transduktion wurde die bakterielle Chemotaxis mit seinem Regulatorprotein CheY aus-gewählt. Die Untersuchungen wurden mit der Internen Totalreflektions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) durchgeführt, welche eine fluoreszente Markierung der zu untersuchenden Moleküle erfordert. Um eine spezifische und hintergrundredu-zierte Markierung zu gewährleisten, werden helle und photostabile fluoreszente ‚Tags‘ benötigt. In dieser Arbeit wurde das SNAP-tag System benutzt, das den Einsatz unter-schiedlicher Farbstoffe erlaubt. Ein Vorteil dieses Systems ist die Verwendung von fluoreszenzgelöschten Benzylguanin (BG)-Farbstoffen, die erst nach erfolgter Markie-rung eine starke Fluoreszenz zeigen. Für die Entwicklung der Markierungsmethode wurden zunächst in Vorexperimenten die Farbstoffe Atto 620, Atto 633, Atto 655 und Atto 680 eingehend auf ihre Fluorogenität, ihre Photostabilität und ihr Blinkverhalten hin analysiert. Die fundierte Kenntnis dieser Eigenschaften ist essentiell für die korrekte Interpretation der aus biologischen Experimenten gewonnen Ergebnissen. Ideal für das Verfahren sind Farbstoffe, die ein hohes Fluoreszenzsignal besitzen, über eine lange Beobachtungszeit stabil sind und nicht mit der Funktion des Zielmoleküls interferieren. Die Voruntersuchungen haben gezeigt, dass Atto 633 unter den getesteten Farbstoffen die besten photophysikalischen Eigenschaften für die Markierung mit dem SNAP-tag System besitzt und zudem die beste Zellgängigkeit aufweist. Es ist damit möglich, ein-zelne Moleküle unter kontinuierlicher Laseranregung über mehrere Sekunden zu be-obachten. Darüber hinaus konnte die Markierungseffizienz in gewissen Grenzen durch die Proteinexpression, die Farbstoffkonzentration und die Inkubationszeit des Farb-stoffs kontrolliert werden. Eine geringe Markierungseffizienz ist für die Einzelmolekül-Detektion von Vorteil, da eine zu hohe Dichte an fluoreszent markierten Molekülen die Identifikation einzelner Moleküle erschwert. Anschließend wurde ein Färbeprotokoll etabliert, welches eine spezifische, hinter-grundreduzierte Fluoreszenz-Markierung einzelner CheY-Proteine in lebenden E. coli-Zellen erlaubt, ohne dass die Funktionsfähigkeit des Proteins beeinträchtigt wird. Echt-zeit-Aufnahmen mit einer Zeitauflösung von 30 ms zeigten, dass es möglich ist, einzel-ne CheY-Moleküle bei der Bindung an einen Interaktionspartner als fluoreszenten Punkt zu beobachten. Aus den Fluoreszenzintensitätsspuren konnten die Bindungszu-stände mittels numerischer Verfahren als An- und Auszeiten extrahiert werden und deren Wahrscheinlichkeitsverteilung bestimmt werden. Aus diesen quantitativen Unter-suchungen zur Bindungskinetik von CheY konnten Hinweise auf spezifische Proteinin-teraktionen beobachtet, jedoch keine detaillierte Auskunft über Bindungszeiten gege-ben werden. Die Ursache hierfür könnten unterschiedliche Wechselwirkungen des Pro-teins, sowohl spezifischer als auch unspezifischer Art, sein. So wäre eine weitere wich-tige Entwicklung dieses Markierungssystems, die Möglichkeit zur gleichzeitigen Fär-bung von zwei oder mehreren Proteinen mit spektroskopisch unterscheidbaren fluores-zierenden ‚Tags‘ (z.B. dem CLIP-tag), um Kolokalisationsexperimente mit alternieren-der Laseranregung durchzuführen. Eine weitere Ursache kann man in der Natur des verwendeten Farbstoffes selbst suchen. Laser- und temperaturabhängige Untersu-chungen könnten weiteren Aufschluss über das Verhalten der Farbstoffe geben. Somit liefert das beschriebene Fluoreszenz-Markierungsverfahren einen neuen Ansatz für quantitative Untersuchungen von Proteininteraktionen in lebenden Zellen.