High-throughput planar solid phase extraction : a new clean-up concept in multi-residue analysis of pesticides

Abstract

Currently, the most serious problems in pesticide residue analysis by liquid chromatography (LC) or gas chromatography (GC) coupled to mass spectrometry (MS) concern the so-called “matrix effects”. The most common way to avoid these effects is the application of matrix-matched calibration standards. Nevertheless, an efficient clean-up undoubtedly is the best way to prevent matrix effects in multi-residue analysis of pesticides in food by LC–MS or GC–MS. For a totally new powerful clean-up method, called high-throughput planar solid phase extraction (HTpSPE), highly automated planar chromatographic tools were applied to remove co-extracted matrix substances entirely and to eliminate any kind of matrix related effects. For sample extraction, the quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe (QuEChERS) method was used to initially collect pesticides from fruits and vegetables. The received acetonitrile extracts were applied directly for the development of the novel HTpSPE clean-up. Thin-layer chromatography (TLC) was used to completely separate pesticides from matrix compounds and to focus them into a sharp zone. A two-fold development on amino-modified silica gel thin-layers with acetonitrile for the first development, and acetone for the second development in the backwards direction, was evaluated to perform the best clean-up result and collect the pesticides in a sharp, single target zone. To easily locate the pesticide zone, the Sudan II dye was added to the extracts. Following this clean-up, the target zones (pesticides) were eluted by the TLC–MS interface into vials for the LC–MS determination. HTpSPE resulted in extracts which were nearly free of co-extracted matrix and matrix effects, as shown for seven chemically representative pesticides (acetamiprid, azoxystrobin, chlorpyrifos, fenarimol, mepanipyrim, penconazole, and pirimicarb) in four different fruit and vegetable matrices (apples, cucumbers, red grapes, and tomatoes). Thanks to the very clean HTpSPE extracts, calibration can simply be performed with pure solvent standards and the quantitation by LC–MS provided excellent mean recoveries and relative standard deviations. In addition, tea samples as rather challenging matrices were chosen to apply for HTpSPE. The matrix load of tea extracts generally was too high for the available thin-layer capacity and the selectivity of the amino-modified phase was not suitable for the separation of caffeine and further matrix compounds from the target analytes (pesticides). By modifying the sample extraction, adding a pre-cleaning by dispersive solid phase extraction (dSPE) and changing the thin-layer phase to normal phase silica gel, the complete separation of pesticides and tea matrix components was possible, when again a two-fold development was applied. Caffeine and other alkaloids were completely removed. The effectiveness of HTpSPE was demonstrated by LC–MS/MS calibration curves from matrix-matched and solvent standards, which were nearly identical and by very good mean recoveries, calculated against pure solvent standards. Concerning all validation parameters, the new acetonitrile-HTpSPE procedure for tea samples was superior to the QuEChERS-dSPE method and offered highly successful results. In recent years, large-scale screening in pesticide residue analysis has gained more and more importance. Keeping this in mind, a screening strategy for HTpSPE extracts, using a high-resolution MS, was developed to analyze the cleaned extracts directly for pesticide residues without a liquid chromatographic separation. By this hyphenation, a completely new microliter-flow injection analysis–time-of-flight mass spectrometry (µL-FIA–TOFMS) screening was introduced. The novel HTpSPE–µL-FIA–TOFMS approach enabled the detection of all pesticides simultaneously in a single mass spectrum within a few minutes. The obtained mass spectra were nearly free of matrix compounds, which is especially the great benefit of the effective HTpSPE clean-up. Recovery studies by HTpSPE–µL-FIA–TOFMS against solvent standards for the matrices and pesticides under study provided excellent results, using the mass signal intensities under the entire FIA sample peak. HTpSPE clearly showed superior results concerning every tested parameter than dSPE. With the help of a self-constructed mass database searching tool, all spiked pesticides were detected and correctly identified, while only very low numbers of false-positive findings occurred. Furthermore, a non-target screening approach was successfully implemented by slightly changing the database searching process, offering a mass list of all substances, which are present in the injected extracts but not included in the mass database. Finally, the new HTpSPE–µL-FIA–TOFMS screening was successfully applied to several real samples, when the identified pesticides were quite identical compared to results of LC–MS/MS analysis of the QuEChERS-dSPE extracts.

In der Rückstandsanalytik von Pestiziden bereiten „Matrixeffekte“ bei der flüssigkeits- oder gaschromatographischen Bestimmung mittels Massenspektrometrie (LC–MS oder GC–MS) die größten Probleme. Standardmäßig versucht man, diese durch Verwendung von matrix-matched Kalibrierstandards zu kompensieren. Trotzdem ist eine effiziente Reinigung der Extrakte zweifelsohne der beste Weg, um diese Effekte in der Pestizidrückstandsanalytik in Lebensmitteln mittels LC–MS oder GC–MS zu vermeiden. Für die Einführung einer völlig neuen, leistungsfähigen Clean-up Methode, der so genannten high-throughput planar solid phase extraction (HTpSPE), wurden hoch automatisierte planar-chromatographische Werkzeuge eingesetzt, um die mitextrahierte Matrix zu entfernen und matrixbedingten Effekten zu beseitigen. Die Probenextraktion erfolgte gemäß der QuEChERS-Methode. Die Acetonitril-Extrakte wurden direkt für die Entwicklung der neuen HTpSPE Reinigung verwendet. Dieses nutzt die Dünnschicht-Chromatographie (DC), um Pestizide und Matrix vollständig voneinander zu trennen und die Wirkstoffe in einer scharfen Zone zu sammeln. Das beste Clean-up Ergebnis ergab eine 2-fache Entwicklung auf Amino-modifizierten DC-Schichten. Die erste Entwicklung erfolgte mit Acetonitril, die zweite Entwicklung mit Aceton in der Rückwärtsrichtung. Vor der HTpSPE wurde den Extrakten der Farbstoff Sudan II als visueller Marker hinzugefügt, wodurch die Pestizidzone einfach zu erkennen ist. Nach diesem Clean-up wurden die Zielzonen mittels des TLC–MS Interface in Gläschen eluiert und mittels LC–MS analysiert. Nach dem HTpSPE Clean-up waren die Extrakte nahezu frei von mitextrahierter Matrix und Matrixeffekte. Dies wurde erfolgreich anhand von sieben chemisch repräsentativen Pestiziden (Acetamiprid, Azoxystrobin, Chlorpyrifos, Fenarimol, Mepanipyrim, Penconazol und Pirimicarb) in vier Obst- und Gemüsematrices (Äpfel, Gurken, roten Trauben und Tomaten) gezeigt. Dank der sehr sauberen HTpSPE-Extrakte kann die Quantifizierung einfach mit reinen Lösungsmittelstandards erfolgen. LC–MS Messungen lieferten exzellente mittlere Wiederfindungen und relative Standardabweichungen. Für eine weitere Anwendung wurden Teeproben als äußerst anspruchsvolle Matrices ausgewählt. Die Matrixfracht der Extrakte war für die Kapazität der DC-Schichten zu hoch und die Selektivität der Aminophase war nicht geeignet, um Koffein und weitere Matrixverbindungen von den Zielsubstanzen (Pestiziden) abzutrennen. Durch die Modifizierung der Extraktion, einer Vorreinigung mittels dispersiver Festphasenextraktion (dSPE) und dem Wechsel der DC-Phase zu unmodifiziertem Kieselgel konnte die vollständige Abtrennung der Matrix von den Pestiziden erreicht werden, wieder in Kombination mit einer 2-fachen Entwicklung. Koffein und andere Alkaloide wurden vollständig entfernt. LC–MS/MS Kalibriergeraden von matrix-matched und Lösemittelstandards und sehr gute mittlere Wiederfindungen, bestimmt gegen Lösemittelstandards, belegten erneut die Leistungsfähigkeit der HTpSPE. Das neue Acetonitril-HTpSPE Verfahren ergab hinsichtlich aller Validierungsparameter zuverlässigere und exaktere Resultate als die QuEChERS-dSPE Methode. In den letzten Jahren ist die allumfassende Analytik mittels Screening-Methoden in der Rückstandsanalytik von Pestiziden immer wichtiger geworden. Vor diesem Hintergrund wurde ein Screening-Konzept für HTpSPE-Extrakte entwickelt, das ein hochauflösendes MS nutzt, um die gereinigten Extrakte auf Pestizidrückstände zu untersuchen, ohne dass eine chromatographische Trennung notwendig ist. Diese Kopplung lieferte eine völlig neue Strategie für ein schnelles Screening, die direkte Mikroliter-Fließinjektionsanalyse mittels Flugzeitmassenspektrometrie (µL-FIA–TOFMS). Der neue HTpSPE–µL-FIA–TOFMS Ansatz ermöglichte die simultane Erfassung aller Pestizide in einem einzigen Massenspektrum innerhalb von wenigen Minuten. Dank der HTpSPE waren die erhaltenen Spektren nahezu frei von Matrixverbindungen. Unter Verwendung der Intensitäten der Massensignale lieferte das HTpSPE–µL-FIA–TOFMS Verfahren sehr gute mittlere Wiederfindungen gegen Lösemittelstandards für alle Matrices und Pestizide die Gegenstand dieser Studie waren. Im Vergleich zur dSPE zeigte die HTpSPE deutlich bessere Ergebnisse für alle getesteten Parameter. Mithilfe einer eigenen, neu entwickelten Datenbank-basierten Suchstrategie wurden alle dotierten Pestizide erkannt und korrekt identifiziert, während nahezu keine falsch-positiven Treffer auftraten. Zusätzlich wurde eine non-target Suchoption erfolgreich etabliert. Sie lieferte eine Liste an exakten Massen aller Probenbestandteile, die in den injizierten Extrakten vorhanden, aber nicht Bestandteil der Datenbank sind. Das neue HTpSPE–µL-FIA–TOFMS Screening wurde schließlich erfolgreich auf diverse reale Proben angewandt. Die identifizierten Pestizide entsprachen denjenigen, die zuvor in einem Handelslabor mittels LC–MS/MS Messungen von QuEChERS-dSPE Extrakten detektiert wurden.