Biogenese und Virusassembly des filamentösen Coliphagen M13

Abstract

Taxonomically, the bacteriophage M13 is assigned to the single-stranded DNA phage and belongs to the family of Inoviridae. For propagation the Gram-negative bacteria Escherichia coli with F-pili is required. The host cell is not lysed by the phage. New findings about the M13 phage biogenesis are presented here within four essential areas of the M13 phage cycle concerning the sections infection, assembly, and phage secretion. Phage adsorption experiments in which the host bacterium E. coli K38 was infected by M13 phage showed that the phage adsorption to the cells takes place within the first 5 minutes and because of a limitation of F-pili per cell a maximum of 7 phages per cell were found to be adsorbed. The insertion of the phage coat protein gp9 into the cytoplasmic membrane of the host cell was verified by the periplasmic location of antigenic epitopes introduced into the N-terminal domain of gp9. The membrane insertion of gp9 was found to depend on the host protein YidC. Plasmid-encoded gp9 exhibiting antigenic epitopes at the N-terminal domain did not interfere with the assembly of new progeny phage. Therefore, the development of a phage display system with gp9 by introducing short peptide sequences (17 ? 36 amino acids) is feasible. After overexpression of gp1/11 assembly complexes in E. coli and size exclusion chromatography, respectively, the complex was characterized and a molecular weight of ~ 300 kDa was assigned. Examinations of the purified gp1/11 assembly complexes by transmission electron microscopy (TEM) revealed ring-like structures with ~ 7 ? 8 nm in inner diameter and ~ 11 ? 12 nm in outer diameter. The investigation of M13 wild-type infection showed that the secretion of new progeny phage starts after a short lag period (eclipse). An infected E. coli cell secreted upto 925 progeny in a time period of 115 minutes which corresponds to an average of 7 secreted phages per minute. The generation time of the infected E. coli K38 cells rose from 24 minutes to 48 minutes. Experiments were carried out with genetically manipulated phages which were hindered to synthesize the major coat protein gp8 in the host cell by a nonsense mutation in the phage genome. Therefore, phage replication was only observed in host cells bearing plasmid encoding gene 8. Since the quantity of the protein was limited the lag period (eclipse) was extended to 12 minutes and the efficiency of phage secretion was decreased to about 2 phages per minute. The M13 phage secretion from infected E. coli cells was visualized by atomic force microscopy (AFM). The identity of the phage was verified by labeling with protein-A conjugated gold and transmission electron microscopy (TEM). The secretion of M13 progeny was first observed at the cell poles of E. coli and then spreaded within 4 minutes along the cell surface. After 16 minutes the secretion was observed over the entire cell surface.

Der Phage M13 ist taxonomisch den Einzelstrang-DNA-Phagen zugeordnet und gehört zur Familie der Inoviridae. Für die Vermehrung verwendet M13 Gram-nega-tive Escherichia coli-Zellen, die F-Pili ausbilden, als Wirt. Durch die Vermehrung wird die Wirtszelle nicht geschädigt. In dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse über die M13-Biogenese erhalten werden, welche den Bereich Infektionsprozess, die Assem-blierung und die Phagensekretion betreffen. Durch Adsorptionsexperimente, in denen das Wirtsbakterium E. coli K38 mit M13-Phagen infiziert wurde, konnte gezeigt werden, dass innerhalb der ersten 5 Minuten die Bindung der Phagen an die Zellen stattfindet und hier aufgrund einer Limitierung der F-Pili pro Zelle maximal 7 Phagen pro E. coli-Zelle binden konnten. Die Insertion des Phagenhüllproteins gp9 in die Zytoplasmamembran der Wirtszelle wurde mit Hilfe antigener Epitope in der N-terminalen Domäne nachgewiesen und es konnte gezeigt werden, dass das YidC-Protein von E. coli dafür benötigt wird. Zudem wurde gezeigt, dass plasmidkodiertes gp9 mit zusätzlich eingebrachten antigenen Epitopen in der N-terminalen Domäne keinen negativen Effekt auf die Assemblierung neuer Phagen-Nachkommen hatte. Daher kann das gp9 durch die Insertion kurzer Peptidsequenzen (17 ? 36 Aminosäuren) für ein ?Phage-Display? verwendet werden. Hinsichtlich der Phagenassemblierung war es möglich, den membranständigen gp1/11-Assembly-Komplex, nach Überexpression in E. coli und Größenausschluß-chromatographie, zu charakterisieren und ihm ein Molekulargewicht von ~ 300 kDa zuzuordnen. Die transmissionselektronenmikroskopische (TEM) Untersuchung des gereinigten gp1/11-Assembly-Komplexes zeigte ringförmige Strukturen mit einem Innendurchmesser von ~ 7 ? 8 nm und einem Außendurchmesser von ~ 11 ? 12 nm. Die Untersuchung der wildtypischen Phagensekretion zeigte, dass nach einer 5-minütigen Latenzphase (Eklipse) die Sekretion neuer Phagen-Nachkommen erfolgte und eine infizierte E. coli-Zelle in einem Zeitraum von 115 Minuten bis zu 925 neue Phagen sekretieren kann, was einer durchschnittlichen Sekretion von 7 Phagen pro Minute entspricht. Durch die M13-Infektion verlängerte sich die Generationszeit der E. coli K38-Zellen von 24 auf 48 Minuten. Die Untersuchung der Phagensekretion und der Phagenreplikation genetisch veränderter Phagen, deren Synthese des Haupthüllproteins gp8 durch das Wirts-bakterium mit Hilfe einer Punktmutation im Phagengenom unterbunden wurde, erfolgte in Wirtszellen mit zusätzlich plasmidkodiertem Gen 8 des Phagen. Es zeigte sich, dass das plasmidkodierte gp8 limitiert war, was eine Verringerung der Phagen-sekretion auf ~ 2 Phagen pro Minute verursachte und die Latenzzeit (Eklipse) auf 12 Minuten verzögerte. Die Sekretion von M13-Phagen aus infizierten E. coli-Zellen konnte mit dem ?Atomic Force Microscope? (AFM) dargestellt und die Phagen am TEM, nach Markierung mit Protein-A konjugiertem Gold, nachgewiesen werden. Die Sekretion von M13-Phagen-Nachkommen begann an den Zellpolen von E. coli und breitete sich im Verlauf von 4 Minuten von diesen zu den Seiten der Zellen hin aus und erstreckte sich nach 16 Minuten über die gesamte Zelloberfläche.