Patch clamp experiments with human neuron-like cells under different gravity conditions

Abstract

Gravitation influences many physical, chemical and biological processes. Cells and their behaviour are no exception. The gravitational impact on the activity of neuronal cells is very important with the perspective of manned space missions. Previous experiments with vertebrates showed that the velocity of neuronal impulses (action potentials) in nerve fibres is decreasing under zero gravity and is increasing at high gravity. There are many theories about the changed properties of the nervous systems under zero gravity, but the molecular principles are mostly unexplored. For this dissertation hardware for patch clamp experiments under microgravity was developed. The patch clamp technique is a common used tool in investigating the electrophysiological properties of cells and single ion channels. Since the conditions during parabolic flights render classic patch clamp nearly impossible, advanced chip-based planar patch-clamp hardware, the Port-a-Patch from Nanion Technologies was integrated into a setup. This setup had to comply with the mandatory design and safety regulations to be used in parabolic flights. Two parabolic flight campaigns were used to validate the hardware, adapt the patch clamp procedures to the special conditions during a parabolic flight (as time pressure and vibrations) and to choose a suitable cell line from the available cell lines. As the laboratory conditions on ground were insufficient at the beginning of the project, the main focus had to lie on robust cells. The SH-SY5Y cell line was chosen for their robustness (they already have been used successfully by other teams) and their origin from the human brain (glioblastoma). During two subsequent parabolic flight campaigns patch clamp experiments were performed and whole cell currents of SH-SY5Y cells were recorded with increasing success rate. Pulse protocols were used to create current-voltage (I-V) characteristics. To obtain 20 seconds of microgravity, two phases of hypergravity, each lasting 20 seconds, had to be endured by the passengers. This fact allowed the subsequent recording of whole cell currents of the same cell during normal Gravity (1g), hypergravity (1.8g) and microgravity (approx. 10-3g) to compare the I-V characteristics of the different gravity conditions. For SH-SY5Y cells it was shown that a gravity dependence of the whole cell currents exists. The micro- and hypergravity whole cell currents were changed compared to 1g flight controls. At -20 and -10mV, the hypergravity current was significantly decreased compared to 1g, by 13.5% at -20mV and by 7.4% at -10mV. A significant 1.8g current < 0g current relation could be observed at potentials between -20 and +10mV. At -20mV the microgravity whole cell currents were increased by 13.5%, at -10mV by 7.4%, at 0mV by 6.2% and at +10mV by 3.9%. The duration and complexity of the used pulse protocols were limited by the time of each gravity phase (20-22 seconds). In a last parabolic flight campaign, therefore the passive electrophysiological properties of the cell membrane were investigated. As the laboratory conditions at the site were greatly improved in the meantime, especially for cell culture, new cell lines could be tested for their usability. SNB19 cells, also originating from the human brain (astrocytoma) were chosen due to their good sealing quality and stability compared to SH-SY5Y cells and constant pulse protocols near the estimated resting potential (-80 and -60mV) were performed. At constant -80mV and -60mV, it was shown that the whole cell currents during the variable gravity conditions are significantly increased compared to the 1g in-flight controls. The hypergravity current of SNB19 was increased by 2.2% at -80V and by 8.2% at -60mV. The microgravity current was increased by 4.1% at -80mV and 3.7% at -60mV. The acquired I-V characteristic of SNB19 differs from the I-V characteristic of SH-SY5Y. These findings show that the planar patch clamp technique can be used in parabolic flights to investigate the electrophysiological properties of single. Furthermore the findings suggest that the electrophysiological properties of single cells originating from the human brain exist are gravity dependent.

Die Schwerkraft beeinflusst viele physikalische, chemische und biologische Prozesse. Zellen und ihr Verhalten bilden dabei keine Ausnahme. Der Einfluss der Gravitation auf die Aktivität neuronaler Zellen ist wichtig, vor allem auch im Ausblick auf bemannte Weltraummissionen. Frühere Experimente mit Wirbeltieren zeigten, dass die Leitungsgeschwindigkeit von Nervenfasern für Aktionspotentiale unter Schwerelosigkeit abnimmt und unter hoher Schwerkraft zunimmt. Es gibt viele Theorien über die veränderten Eigenschaften des Nervensystems in der Schwerelosigkeit, aber die molekularen Grundlagen sind bis heute weitgehend unbekannt. Für diese Arbeit wurde die Hardware für ein Patch Clamp System entwickelt, welches in der Schwerelosigkeit eingesetzt werden kann. Die Patch Clamp Technik ist ein verbreitetes Werkzeug um die elektrophysiologischen Eigenschaften von Zellen und einzelnen Ionenkanälen zu untersuchen. Da die Bedingungen während eines Parabelfluges klassisches Patchen beinahe unmöglich machen wurde ein planares Patch Clamp System, der Port-a-Patch von Nanion, in einen Experimentaufbau integriert. Der Experimentaufbau wurde nach den Konstruktions- und Sicherheitsregeln entwickelt und gebaut, die für die Teilnahme an Parabelflügen vorgeschrieben waren. Zwei Parabelflugkampagnen wurden verwendet um den Entwurf bezüglich Funktionalität und Sicherheit zu validieren. Des Weiteren wurden die Patch Clamp Prozeduren an die speziellen Bedingungen während des Parabelflugs (wie Zeitdruck und Vibrationen) angepasst, und eine passende Zelllinie wurde aus den zur Verfügung stehenden Kulturen ausgewählt. Da die Laborbedingungen vor Ort zu Beginn des Projekts nicht ausreichend waren musste das Hauptaugenmerk auf der Unempfindlichkeit der Zelllinie liegen. Die Zelllinie SH-SY5Y wurde aufgrund ihrer Robustheit (sie wurde bereits von anderen Gruppen erfolgreich verwendet) und ihrem Ursprung aus dem menschlichen Hirn (Glioblastom) ausgewählt. Während zwei folgender Parabelflugkampagnen wurden Patch Clamp Experimente mit steigender Erfolgsrate durchgeführt und Ganzzellströme von SH-SY5Y Zellen wurden aufgezeichnet. Spannungsprotokolle wurden verwendet um Strom-Spannungs-Kennlinien (I-V) zu erstellen. Um 20 Sekunden Schwerelosigkeit im Flugzeug zu erhalten waren zwei Hypergravitationsphasen, jeweils 20 Sekunden lang, notwendig. Dies wiederum ermöglichte die aneinandergereihte Aufnahme von Ganzzellströmen derselben Zelle während normaler Schwerkraft, Hypergravitation (1.8g) und Mikrogravitation (ca. 10-3g). Dadurch konnten die I-V-Kennlinien der einzelnen Gravitationsphasen miteinander verglichen werden. Für SH-SY5Y Zellen konnte gezeigt werden, dass eine Schwerkraftabhängigkeit der Ganzzellströme existiert. Verglichen mit den 1g-Kontrollen während des Fluges änderten sich die Ganzzellströme während der veränderten Schwerkraftbedingungen. Bei -20 und -10mV waren die Ganzzellströme signifikant erniedrigt, um 13,5% bei -20mV und um 7,4% bei -10mV. Ein signifikantes 1.8g-Ströme < 0g-Ströme Verhältnis konnte zwischen -20 und +10mV beobachtet werden. Im Vergleich zu den Mikrogravitations-Strömen waren die 1.8g-Ganzzellströme bei -20mV um 13,5%, bei -10mV um 7,4%, bei 0mV um 6,2% und bei +10mV noch um 3,9% vergrößert. Die verwendeten Spannungsprotokolle wurden in ihrer Dauer und Komplexität durch die Länge der einzelnen Gravitationsphasen (20-22 Sekunden) limitiert. In einer letzten Parabelflugmission wurden deshalb die passiven elektrophysiologischen Eigenschaften der Zellmembran untersucht. Da sich inzwischen die Laborbedingungen vor Ort, vor allem für Zellkulturen, stark verbessert hatten konnten neue Zelllinien getestet werden. SNB19 Zellen, die ihren Ursprung ebenfalls im menschlichen Hirn (Astrozytom) haben, wurden aufgrund ihres, im Vergleich zu SH-SY5Y, sehr guten Sealverhaltens (Wahrscheinlichkeit und Stabilität) ausgewählt. Es wurden konstante Pulsprotokolle nahe des vermuteten Ruhepotentials (-80 und -60mV) von SNB19 Zellen durchgeführt. Bei -80 und -60mV konnte gezeigt werden, dass die Ganzzellströme von SNB19 Zellen unter Hyper- und Mikrogravitation verglichen mit den 1g-Flugkontrollen signifikant erhöht sind. Die 1,8g-Ganzzellströme waren bei -80MV um 2,2% erhöht, bei -60mV um 8,2%. Die Ströme unter Mikrogravitation waren bei -80mV um 4,1%, bei -60mV um 3,7% erhöht. Diese Ergebnisse zeigen, dass die planare Patch Clamp Technik im Rahmen von Parabelflugmission erfolgreich verwendet werden kann um die elektrophysiologischen Eigenschaften von einzelnen Zellen zu untersuchen. Weiterhin legen die Ergebnisse nahe, dass die elektrophysiologischen Eigenschaften von Zellen, welche ihren Ursprung im menschlichen Gehirn haben, gravitationsabhängig sind.